磷酸鹽對大腸桿菌發酵異亮氨酸的影響*

孫家凱，吳曉嬌，王晶，徐慶陽，謝希賢，陳寧

(天津科技大學生物工程學院，工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津，300457)

L-異亮氨酸屬于分支鏈氨基酸，是人體必需氨基酸之一，具有多種生理功能，廣泛應用于醫藥、食品及其調味劑、動物飼料、化妝品的制造，尤其是在醫學研究和治療中的作用日益受到重視［1］。目前利用微生物生產L-異亮氨酸的方法主要有添加前體發酵法和直接發酵法。異亮氨酸產生菌大多由谷氨酸產生菌谷氨酸棒桿菌、乳糖發酵短桿菌及大腸桿菌選育而來。當前工業化生產中廣泛應用的菌株為谷氨酸棒桿菌，但傳統誘變育種獲得的L-異亮氨酸高產菌株副生雜酸比較多，尤其是丙氨酸、賴氨酸、蛋氨酸等，這對后提取高純度L-異亮氨酸造成很大的困難，同時由于發酵周期長(約70～96 h)，易染菌，從而使發酵成本增加，這也是異亮氨酸價格高昂的重要原因。由于大腸桿菌遺傳背景清楚，繁殖迅速，培養代謝易于控制并且容易實現外源基因的高效表達，因此利用大腸桿菌構建能夠生產異亮氨酸的基因工程菌具有廣泛的應用前景。

磷酸鹽既能夠控制菌體的DNA、RNA和蛋白質的合成，也能控制糖的代謝作用、細胞的呼吸和胞內ATP水平［2］。磷酸鹽的含量能夠影響重組大腸桿菌表達質粒復制的速率，因而是菌體生長和目的蛋白表達量的決定性因素之一［3］。磷酸鹽濃度能夠影響大腸桿菌比生長速率，而乙酸的生成又與比生長速率息息相關，有害代謝物對重組菌存在抑制作用是影響大腸桿菌高密度發酵的重要因素，因此控制適宜的磷酸鹽濃度對提高異亮氨酸產量具有重要意義。在前期實驗以E.coli K12為出發菌株所構建的異亮氨酸工程菌的基礎上，本文研究了磷酸鹽對菌體生長、副產物生成、耗氨及產酸等影響，確定了L-異亮氨酸發酵過程中初始磷酸鹽的濃度以及補加濃度，在達到高密度培養的同時實現L-異亮氨酸的增產。

1 材料和方法

1.1 菌株

E.coli TRFP，該菌株是以E.coli K12為出發菌株，經傳統誘變選育得到SG及α-AB雙重抗性突變株后，轉化包含蘇氨酸操縱子及蘇氨酸脫水酶基因的表達質粒pthr101后而得到的L-異亮氨酸工程菌，由天津科技大學工業微生物菌種保藏室提供。

1.2 培養基

種子培養基(g/L):葡萄糖 30，酵母粉 10，(NH4)2SO410，MgSO4·7H2O 5，KH2PO41，玉米漿20，氯霉素50 mg，pH 7.0 ～7.2，0.75 ×105Pa滅菌15 min。

發酵培養基(g/L):葡萄糖 30，(NH4)2SO44，微量元素混合液 5 mL，MgSO4·7H2O 1，KH2PO42，玉米漿 20，FeSO4·7H2O 100 mg，氯霉素 50 mg，pH 7.0～7.2，0.75×105Pa滅菌15 min。

1.3 培養方法

活化斜面培養:37℃恒溫培養36 h。

5 L種子罐(上海保興)培養:吸取適量無菌生理鹽水于3支活化斜面中，將所有菌懸液接入裝5 L種子罐中，初始裝液量為3 L，初始通氣量3 L/min;攪拌轉速300～500 r/min;通過自動流加氨水控制pH值在7.0;培養溫度37℃;以泡敵消泡;待種子培養液OD600為10～20時，按10%接種量接入發酵培養基中。

30 L發酵罐(上海保興)發酵培養:按10%接種量將種子液接種于30 L發酵罐中，初始裝液量為16 μL;初始通氣量3 L/min;攪拌轉速500 ～800 r/min;通過自動流加氨水控制pH值在7.0;培養溫度37℃;以泡敵消泡;發酵時間34 h。

1.4 分析方法

菌體生物量及菌體比生長速率μ［4］:菌體生物量以菌體干重表示，取10 mL發酵液，10 000 r/min離心20 min，將菌體用蒸餾水洗滌2次后置于真空干燥箱中80℃干燥至恒重，用分析天平稱重;菌體比生長速率μ定義為:單位質量菌體的瞬時增量，計算公式:

其中，X、x均為菌體量(g/L)，t為時間(h)，μ 為每克菌體在1 h內菌體增加的質量(g)，μ的單位為h－1。用Origin繪圖軟件對實驗數據進行插值計算(時間間隔為0.1 h)，再用Excel軟件求解不同時刻的μ。

L-異亮氨酸含量:采用高效液相分析系統測定。色譜分離條件:Agilent C18(15 mm×4.6 mm，3.5 μm)，2，4-二硝基氟苯柱前衍生測定，乙腈與NaAc溶液進行梯度洗脫，柱溫33℃，流動相流量1 mL/min，檢測波長360 nm。

磷酸鹽、乙酸及NH4+濃度:采用BioProfile 300A Nova(美國Nova Biomedical公司)生化分析儀測定。

2 結果與討論

2.1 磷酸鹽初始濃度對異亮氨酸分批發酵的影響

由表1可知，隨著磷酸鹽濃度的增加，最大比生長速率與生物量明顯增加，但磷酸鹽濃度在8～12 g/L時最大生物量卻無明顯變化，而高于12 g/L時反而下降，說明磷酸鹽濃度過高后對菌體生長有一定的抑制作用。對于產酸而言，在磷酸鹽濃度為4 g/L時得到最大產量，但與磷酸鹽濃度為2 g/L時差別不大，且高于4 g/L后產量下降?？梢钥闯?，在一定范圍內，隨著磷酸鹽濃度的增加產酸也相對增加，但過高后產酸呈現下降趨勢。另外，磷酸鹽初始濃度越大，菌體進入衰退期的時間越早，而發酵周期也越短。

表1 不同初始磷酸鹽濃度對異亮氨酸發酵的影響

2.2 磷酸鹽對比生長速率的影響

發酵過程中比生長速率μ是一個重要的參數，它能夠影響細胞膜結構［6］、質粒的拷貝數、副產物乙酸的產生。在不同的比生長速率下，雖然mRNA數量無明顯差異，核糖小體的數量卻隨著比生長速率的增大而增大，從而決定了細胞在高比生長速率下的蛋白合成能力更強［7］。而低比生長速率下能夠有效地減少乙酸生成和降低耗氧速率，從而更容易達到高密度培養。因此發酵過程需控制適宜的比生長速率，在達到高密度發酵培養的同時實現異亮氨酸的高產。

圖1 不同磷酸鹽濃度下細菌比生長速率的變化曲線

由圖1可知，發酵過程中，不同磷酸鹽濃度下E.coli TRFC的比生長速率存在顯著差異。隨著磷酸鹽濃度的增加，菌體的延滯期明顯縮短，細胞比生長速率達到最大值的時間逐漸縮短。當磷酸鹽濃度為8 g/L時，7 h達到最大值0.35/h，然后迅速降低，18 h左右進入穩定期。在較高磷酸鹽濃度4 g/L與8 g/L時比生長速率差異較小，但前者的最大比生長速率較后者小，大約8 h達到最大值0.30/h，約22 h才進入穩定期。而在低磷酸鹽濃度2 g/L與1 g/L時最大比生長速率差異較小(約0.27/h)，且兩者達到最大比生長速率均在10 h之后，然后緩慢下降，但是磷酸鹽濃度為1 g/L時，其延滯期最長，約4～5 h后才進入對數生長期，且其最大生物量也最小，如圖2。由此可知，在高濃度磷酸鹽條件下，雖然可以得到較大的生物量，但是其后期發酵無力，衰退較快。因此，需控制適當低的磷酸鹽濃度(2～4 g/L)既保證得到較大生物量又能延緩衰退。

圖2 不同磷酸鹽濃度下生物量的變化曲線

2.3 磷酸鹽補加對異亮氨酸發酵的影響

由L-異亮氨酸在磷酸鹽2 g/L時發酵過程曲線(圖3)可知，0～4 h為延滯期，4 h后進入對數生長期，16 h后既進入對數生長期后期，菌體生長明顯減緩;而異亮氨酸從6 h開始積累，16 h后產酸趨勢明顯減緩，而此時發酵液中磷酸鹽也幾乎耗盡，后期發酵無力。因此通過補加2 g/L的磷酸鹽以強化后期發酵。從圖4可以看出，未添加磷酸鹽時，25 h左右菌體進入穩定期，磷酸鹽初始濃度為2 g/L與4 g/L時達到的最大生物量分別為31.9 g/L和36.5 g/L，而在對數生長期中后期添加一定濃度(2 g/L)的磷酸鹽會發生二次生長現象，能夠在一定程度上減緩菌體衰退，菌體22 h后才進行穩定期，且其最大生物量達到39.7 g/L，較前兩者菌體生物量分別提高24.5%和8.7%。異亮氨酸產量也較前兩者分別提高12.7%和9.2%。

圖3 磷酸鹽濃度為2 g/L時L-異亮氨酸發酵過程曲線

圖4 添加2 g/L KH2PO4時對異亮氨酸發酵的影響

2.4 磷酸鹽對副產物乙酸的影響

乙酸是大腸桿菌高密度培養過程中的主要的抑制性代謝副產物，發酵過程中乙酸的過多積累會導致菌體過早地衰老、自溶、比活性較低。高濃度的乙酸能減緩生長速率，能夠在很大程度上降低補料分批培養中的生物量，乙酸的積累也是影響重組蛋白表達的重要因素［8］。Koh發現，乙酸對重組蛋白細胞的抑制作用比野生型細胞更為明顯［9］;據報道［10］，乙酸濃度大于5 g/L時就能減緩生長速率，降低生物量，當培養液中乙酸濃度大于12 g/L時外源蛋白的表達完全被抑制。

圖5 不同磷酸鹽濃度下乙酸的變化曲線

由圖5可知，在發酵初期，發酵液中幾乎沒有乙酸的積累，但是，在菌體進行對數生長期后，乙酸的積累均急劇增加，并且磷酸鹽濃度越高積累的乙酸速度越快。其中，磷酸鹽濃度為1 g/L和2 g/L時乙酸生成趨勢大致相同。初始磷酸鹽濃度分別為1 g/L、2 g/L、4 g/L和8 g/L時，積累乙酸的最大濃度依次為174.2 mmol/L、197.1 mmol/L、221.5 mmol/L 和239.8 mmol/L，這說明初始磷酸鹽濃度越高，越容易積累高濃度的乙酸。另外當磷酸鹽濃度低于4 g/L時，菌體進入穩定期后乙酸濃度均有不同程度的下降，而磷酸鹽濃度為8 g/L時，后期乙酸濃度無明顯下降，這可能是由于在較低的磷酸鹽濃度下，發酵后期菌體活力相對較強，能夠消耗一部分的乙酸，而高濃度的磷酸鹽條件下后期發酵環境惡劣，菌體活力弱，對乙酸的耐受能力更差，因而菌體分解利用乙酸的能力較弱。

在大腸桿菌發酵過程中，乙酸產生主要有兩個原因，即葡萄糖的攝入速率大于TCA循環的周轉能力和通過呼吸鏈和氧化磷酸化的電子傳遞受到限制［11］。由圖2可知，隨著磷酸鹽濃度的增加，發酵過程中菌體的最大比生長速率也相應增加。而在高比生長速率時，大腸桿菌僅靠氧化代謝不能提供足夠的能量，必須通過乙酸生成途徑儲備ATP和NADH2以滿足代謝能量需求［12］;同時當磷酸鹽濃度增加時，糖酵解途徑的活性大幅度提高，菌體利用葡萄糖的速率也相應增加。因此，在高磷酸鹽濃度的情況下雖然具有較高的比生長速率，但是易產生大量副產物乙酸，而乙酸的積累影響生物量的進一步增加，同時外源基因的表達也受到嚴重影響。

2.5 磷酸鹽對濃度的影響

大腸桿菌高密度發酵過程中，穩定的pH是保證菌體最佳生長狀態的必要條件，代謝副產物乙酸和發酵產物異亮氨酸的積累，都會使發酵液的pH值下降，因而會消耗大量的氨水以維持pH的穩定，但是大腸桿菌對銨的利用能力有限，當濃度的增加至一定濃度后會對菌體產生毒害作用。Thompson認為濃度高于170 mmol/L時會抑制大腸桿菌的生長，濃度高于480 mmol/L時菌體的生長完全停止［13］。

圖6 不同磷酸鹽濃度下濃度的變化曲線

3 討論

重組大腸桿菌的高密度發酵培養技術能夠提高產物的比生產率，提高設備利用率從而降低生產成本。但是在該技術實際應用中卻遭遇諸多問題，其中最為嚴重的就是培養過程中菌體過早地衰老和外源基因表達率低，這主要是由于有害代謝物對重組菌存在抑制作用。

將菌體的比生長速率控制在一定的閥值內，可有效減少乙酸的生成［15］，而利用大腸桿菌表達外源蛋白通常需要較高的比生長速率以獲得高的表達水平［16］，因此可通過基因工程手段消除乙酸的產生。Cho等通過修改大腸桿菌染色體上mLc基因的啟動子區域，從而使乙酸的產生降低了50%，而重組蛋白的表達量也大大提高［17］。Aristidou等通過表達枯草芽孢桿菌的乙酰乳酸合成酶，從而將多余的丙酮酸轉化成毒性較更小的副產物3-羥基丁酮，最終在將乙酸生成減少75%的同時，重組蛋白的表達量提高了兩倍［18］。在發酵初期若磷酸鹽過多，會導致前期菌體生長旺盛，后期發酵無力易衰退的現象，同時乙酸也會過多積累，而濃度隨著乙酸濃度的增加而增加，兩者相互影響，從而加劇菌體衰退。而細胞環境中濃度增加，降低了細胞對能量的利用效率，使細胞能量供應不足，導致細胞生長受阻，菌體生物量下降［19］。通過基因工程手段減少副產物乙酸的生成，然后提高發酵初期磷酸鹽的濃度，從而提高發酵過程中的比生長速率，在得到較高的生物量的同時，實現外源蛋白的大量表達。

本文研究表明，在發酵初期降低磷酸鹽濃度(KH2PO4濃度控制在2 g/L)，中后期補加2 g/L KH2PO4，可顯著減緩菌體衰退，有效避免了高濃度磷酸鹽條件下副產物乙酸的過多積累，明顯提高了生物量和異亮氨酸的產量，這對工業化發酵生產L-異亮氨酸提供了理論依據并具有一定實用價值。

［1］ 宋文軍，陳寧，魏春，等.基于代謝流導向與分析的L-異亮氨酸發酵條件優化［J］．天津輕工業學院學報，2003，18(2):15－19.

［2］ Clift R，Grace J R.Bubbles，Drops and Particles［M］．New York:The Academic Press，1978.

［3］ 徐皓，李民，阮長慶，等.高密度發酵生產突變型重組人腫瘤壞死因子 rhTNFα-DK2的研究［J］．工業微生物，1998，28(2):230－234.

［4］ 劉慧娟，華兆哲，堵國成，等.芽孢桿菌發酵生產堿性果膠酶的溫度控制策略［J］．過程工程學報，2007，7(4):786－789.

［5］ 張蓓.代謝工程［M］．天津:天津大學出版社，2003:133－134.

［6］ Shokri A，Sandén A-M，Larsson G.Growth rate-dependent changes in Escherichia coli membrane structure and protein leakage［J］．Applied Microbiology and Biotechnology，2002，58(3):386－392.

［7］ Ryan W，Collier P，Loredo L，et al.Growth Kinetics of Escherichia coli and expression of a recombinant protein and its isoforms under heat shock conditions［J］．Biotechnology Progress，1996，12(5):596－601.

［8］ Josphe Shiloach，Ursula Rinas．Glucose and acetate metabolism in E.coli-system level analysis and biotechnological applications in protein production processes［J］．Biomedical and Life Science，2009，377－400.

［9］ Koh B T.Comparison of acetate inhibition on growth of host and recombinant E.coli K12 strains［J］．Biotechnol Lett，1992，14:1 115 －1 118.

［10］ 鐘根深，石炳興，吳祖澤，等.重組大腸桿菌高密度培養［J］．中國生物工程雜志，2005(S1)，27－31.

［11］ 張曉云，葉勤.大腸桿菌乙酸產生及其控制研究［J］．生物技術通報，2009(10):66－69.

［12］ Han K，Lim H C，Hong J.Acetic acid formation in Escherichia coli［J］．Biotechnol Bioeng，1992，39(6):663 －771.

［13］ Thompson B G，MKole M，Gecson D F.Control of ammonium concentration in Escherichia coli fermentations［J］．Biotechnology and Bioengineering，1985，27(6):818－824.

［14］ 白亞磊，徐慶陽，謝希賢，等.溶氧控制對黃色短桿菌YILW合成L-異亮氨酸的影響［J］．天津科技大學學報，2011，26(1):5－9.

［15］ Lee S Y.High cell-density culture of Escherichia coli［J］．Trends Biotechnol，1996，14(3):98 －105.

［16］ Sandén A-M，Prytz I，Tubulekas I，et al．Limiting factors in Escherichia coli fed-batch production of recombinant proteins［J］．Biotechnology and Bioengineering，2002，81(2):158－166.

［17］ Cho S，Shin D，Ji G E，et al.High-level recombinant protein production by overexpression of mlc in Escherichia coli［J］．J Biotechnol，2005，119(2):197 － 203.

［18］ Aristidou AA，San K Y，Bennett G N.Metabolic engineering of Escherichia coli to enhance recombinant protein production through acetate reduction［J］．Biotechnol.Prog，1995，11(4):475－478.

［19］ Buurman E T，Mattos M J，Neijssel O M.Futile cycling of ammonium ions via the high affinity potassium uptake system(Kdp)of Escherichia coil［J］．Arch Microbiol，1991，155(4):391－395.