山杏果肉可溶性膳食纖維的抗氧化活性與紅外光譜分析*

崔潔，顧欣，黃昆，王文江，李迪，王建中

(北京林業大學生物科學與技術學院，北京，100083)

山杏Armeniaca sibirica(L.)Lam.薔薇科杏屬植物，主要分布于我國黑龍江、吉林、遼寧、內蒙古、甘肅、河北、山西等省區［1］。山杏為我國三北防護林的主栽樹種之一，現有栽培面積約占三北防護林保存面積的1/8，果實年產量約20～30萬t，果肉、杏核各約10～15萬t。由于山杏果肉酸澀適口性差，生產中被直接廢棄，不僅造成資源的嚴重浪費，還經常導致環境污染。研究發現山杏果肉中膳食纖維含量較高(超過50%)，以此為切入點，開展山杏果肉可溶性膳食纖維制備及其抗氧化活性研究，對于將山杏果肉變廢為寶，降低其相關產品生產成本，保護環境，都至關重要［2］。

本文通過總還原力測定、清除DPPH自由基、清除羥基自由基和清除超氧陰離子4種評價方法，分析比較微生物發酵液酶解法和復合酶酶解法制備的山杏果肉可溶性膳食纖維的抗氧化活性，同時分析比較了兩者的紅外光譜圖。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

承德平泉縣提供的山杏果肉，經45℃烘干，磨粉，過40目篩，備用。

1，1-二 苯 基-2-苦 肼 基 (1，1-dipheny1-2-picrylhydrazyl，DPPH)，Sigma 公司;VC，2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)，鄰苯三酚，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉，氯化鈉，鐵氰化鉀，三氯醋酸，三氯化鐵，三羥甲基氨基甲烷(Tris)，鄰菲羅啉，硫酸亞鐵，雙氧水，氫氧化鈉，天津市津科精細化工研究所，分析純試劑;98%濃硫酸，無水乙醇，鹽酸，北京化工廠，分析純試劑。

綠色木霉(中科院微生物所購得)發酵液，糖化酶，堿性蛋白酶(北京科百奧生物技術有限公司)，纖維素酶(北京奧博星生物技術有限責任公司)。

試驗用水為蒸餾水。

1.2 試驗儀器

752 Spectrophotometer紫外分光光度計，上海美譜達儀器有限公司;Thermo BIOFUGE PRTMO R centrifuge，美國 Thermo Fisher Scientific公司;SHZ-往復式水浴恒溫振蕩器，太倉市實驗設備廠;SHB-3循環水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司;RE-5203旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠;Thermo Heto Power Dry LL1500 Freeze Dryer，美國 Thermo Fisher Scientific公司;Nesus670紅外光譜儀，美國Nicolet公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 微生物發酵液酶解法制備山杏果肉可溶性膳食纖維

稱取10 g山杏果肉，按1∶15的料液比加入綠色木霉發酵粗酶液，45℃恒溫水浴6 h，反復離心3次取上清，旋蒸濃縮后，以4倍體積的無水乙醇沉淀，再離心，取沉淀，用少量水溶解，冷凍干燥，記作F-SDF，備用［3］。

1.3.2 復合酶酶解法制備山杏果肉可溶性膳食纖維

稱取10 g山杏果肉，按按1∶15的料液比加入蒸餾水，混勻，用酸度計將pH值調至4.5，加入糖化酶0.2 g，50℃水浴振蕩1 h，之后再調節 pH值至7.5，加入纖維素酶0.2 g，55℃水浴振蕩1 h，再調節pH值至8.2，加入堿性蛋白酶0.02 g，55℃水浴振蕩1 h，然后反復離心3次取上清，以下步驟同微生物發酵液酶解法，記作E-SDF，備用。

1.3.3 不同梯度參照物和樣品濃度的制備

用蒸餾水分別溶解2種不同方法制備的山杏果肉SDF，天然抗氧化劑VC，并配制成以下所需的相應濃度，備用;用無水乙醇溶解BHT并配制成以下所需的不同濃度，備用。

1.3.4 山杏果肉可溶性膳食纖維(SDF)清除DPPH自由基測定

稱取0.003 8～0.004 0 g DPPH，用無水乙醇溶解，定容至50 mL，搖勻得到濃度為2×10－4mol/L的DPPH溶液，放在冰箱中避光保存備用。在10 mL離心管中分別加入2 mL不同濃度梯度的E-SDF，FSDF，BHT和VC溶液，再分別加入2 mL DPPH溶液，避光反應30 min后在波長517 nm處測定吸光度。以2 mL樣品溶液加入2 mL無水乙醇作為對照，以2 mL DPPH溶液加入2 mL蒸餾水作為空白，計算對DPPH自由基的清除率。以無水乙醇溶液作為參比，如此重復3次，取平均值［4－7］。公式如下:

DPPH·清除率/%=［1－(A－B)/C］×100

式中:A，DPPH溶液+樣品溶液的吸光度值;B，樣品溶液+無水乙醇的吸光度值;C，DPPH溶液+蒸餾水的吸光度值。

1.3.5 山杏果肉可溶性膳食纖維(SDF)總還原力的測定

分別取1mL不同濃度的樣品溶液于10 mL離心管中，加入2 mL磷酸鹽(PBS)緩沖液(0.2 mol/L，pH 6.6)和2 mL 1%鐵氰化鉀溶液，混勻，50℃水浴20 min，取出，加入2 mL 10%三氯乙酸溶液，混勻，迅速冷卻。然后，取2 mL上述混合液于10 mL離心管中，加入2mL蒸餾水水和0.4 mL 0.1%的三氯化鐵溶液，混勻，測定其在700 nm處的吸光度(A700)，以A700表示樣品的還原能力，以蒸餾水為空白，每個樣品做3 個平行，取其平均值［8］。

1.3.6 山杏果肉可溶性膳食纖維(SDF)清除羥基自由基(·OH)的測定

稱取0.020 9 g FeSO4·7H2O，于100 mL容量瓶中準確定容，得0.75 mmol/L FeSO4溶液;稱取0.148 7 g鄰二氮菲，用無水乙醇定容到10 mL容量瓶中，再取1 mL稀釋至100 mL得到0.75 mmol/L的鄰二氮菲溶液;用微量移液器量取166.7μL 30%的雙氧水用蒸餾水定容至50 mL容量瓶中，得到0.1%的H2O2。

在10 mL的離心管中分別加入1 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲溶液，2 mL 0.2 mol/L pH 7.4的磷酸緩沖溶液，1 mL蒸餾水，充分搖勻后，加入0.75 mmol/LFeSO4溶液1 mL，混勻后再加入H2O21 mL，37℃水浴反應60 min后，在536 nm處測定吸光度Af。

用蒸餾水代替上述方法中H2O2測定吸光度Ao。

用不同濃度試樣代替上述方法中的蒸餾水，測定吸光度Ax。

以蒸餾水代替樣品作為空白［9－11］，3 次平行，取平均值。按照如下公式進行計算:

羥基自由基(·OH)清除率/%=［(Ax－Af)/(Ao－Af)］×100

1.3.7 山杏果肉可溶性膳食纖維(SDF)清除超氧陰離子(O2－)的測定

稱取三羥甲基氨基甲烷(Tris)12.11 g，用蒸餾水溶解定容至1 000 mL，得到0.1 mol/L Tris溶液;取50 mL 0.1 mol/LTris溶液與22.9 mL 0.1 mol/L HCl混勻并用蒸餾水稀釋至100 mL，調整pH值為8.2，得50 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液;稱取0.315 g鄰苯三酚用10 mmol/L鹽酸溶解定容至100 mL，得到25 mmol/L鄰苯三酚，棕色瓶，避光保存。

取50 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH=8.2)2.25 mL，加入2 mL不同濃度的待測樣品(對照加蒸餾水)，然后加入25 mmol/L的鄰苯三酚1mL，混勻后25℃水浴20 min，然后滴入10 mol/L的HCl 1滴，終止反應，在420 nm處測吸光度，重復3次，取平均值。按以下公式計算樣品對O－2·的清除率［12］。

超氧陰離子(O－2·)清除率/%=［1－(A1－A2)/A3］×100

式中:A1，Tris-HCl+樣品+鄰苯三酚+HCl的吸光度值;A2，Tris-HCl+樣品+HCl的吸光度值;A3，Tris-HCl+鄰苯三酚+鹽酸的吸光度值。

1.3.8 山杏果肉SDF的紅外光譜分析

稱取兩種不同方法制備的SDF各2 mg，稱取200 mg的溴化鉀粉末2份，分別將樣品與KBr粉末在瑪瑙研缽中研成細粉并混勻，壓片，置于紅外光譜儀中進行測定。掃描范圍為4 000～400 cm－1;分辨率8 cm－1，掃描次數32 次。

2 結果與分析

2.1 山杏果肉SDF抗氧化結果分析

2.1.1 對DPPH自由基的清除能力測定結果

1，1-二苯基苦基苯肼(DPPH·)是一種穩定的有機自由基，在可見光區的517 nm處存在最大吸收峰，其濃度與吸光度呈線性關系，通過被測物質對DPPH自由基的清除能力可以表示其抗氧化性的強弱。

由圖1可知，低于0.10 mg/mL濃度時，抗氧化劑(VC，BHT等)明顯比2種不同方法制備的SDF的清除能力強，這是因為抗氧化劑是純品，單位體積內濃度相對高，而制備的樣品粗提物純度低所致。隨濃度升高，抗氧化劑清除率曲線變化并不明顯，而2種SDF的清除率呈明顯上升趨勢，在0.60 mg/mL處，E-SDF和F-SDF的清除效果均很接近抗氧化劑水平，分別達到了84.23%，61.39%。相同濃度時，E-SDF的對DPPH自由基的清除效果優于F-SDF。

圖1 E-SDF與F-SDF清除DPPH自由基能力比較

2.1.2 總還原力測定結果

還原能力的測定是以樣品是否為有效的電子供應者為評價指標的。若是有效的電子供應者，其供應的電子可將Fe3+還原成Fe2+，還可與自由基形成較惰性物質，從而中斷自由基連鎖反應。一般情況下，物質的吸光度越大，還原能力越強，其抗氧化能力也越高。

由圖2可知，當濃度在0.20 mg/mL時，BHT的吸光度值就已經達到了1.03以上，而 E-SDF是0.19，F-SDF稍好0.22。隨濃度增加，吸光度值增加趨勢緩和，可以看出，相同濃度時抗氧化劑BHT的總還原能力明顯優于山杏果肉SDF。當濃度達到1 mg/mL時，E-SDF的還原能力達到0.83，F-SDF則達到0.59，均明顯低于BHT。將BHT在同等濃度下稀釋10倍后是0.72，它的總還原能力介于F-SDF和ESDF之間，即1 mg/mL的山杏果肉SDF的總還原力相當于BHT/10的還原能力。

2.1.3 對羥基自由基(·OH)的清除結果

鄰二氮菲-Fe2+被反應體系產生的經自由基氧化后紅色褪去，吸收峰大幅度下降，反應前后的變化可反映羥自由基氧化的累積效應，確定待測樣品的存在是否對(·OH)有清除作用。

圖2 E-SDF和F-SDF的總還原力比較

由圖3可知，VC對·OH的清除效果明顯優于E-SDF和 F-SDF的粗提物，當濃度為0.60 mg/mL時，E-SDF的清除率是30.55%，F-SDF為18.02%。隨濃度升高，清除率呈遞增趨勢，前者較后者趨于平緩。當濃度達到3 mg/mL時，E-SDF清除率達到62.24%，F-SDF達到65.89%，清除率超過 E-SDF。同時，VC在相同濃度范圍內，清除率從90.91%到98.14%，變化幅度雖然不明顯，但是一直處于較高的清除水平，這與VC是純品有關，鑒于樣品本身顏色，若繼續增加樣品濃度進行對比勢必干擾測定結果，故未提升樣品濃度。

圖3 E-SDF和F-SDF對羥基自由基(OH·)的清除能力比較

采用改良的鄰苯三酚自氧化方法，鄰苯三酚在堿性條件下易發生自身氧化，產生和有色中間產物，能促進鄰苯三酚自氧化，通過測定物質是否對鄰苯三酚自氧化有抑制作用，可評價其對的清除能力。

由圖4可知，當濃度為0.60 mg/mL時，E-SDF，F-SDF，BHT清除率分別是 23.93%，29.93%，72.13%，當濃度大于0.80 mg/mL時，E-SDF的清除率逐漸超過F-SDF。而后隨濃度增加，E-SDF的清除率的增加趨勢明顯強于F-SDF和抗氧化劑BHT。當濃度達到3 mg/mL時，E-SDF，F-SDF，BHT清除率分別達到了99.67%，72.72%，89.56%?？梢?，2種方法制備的SDF對的清除能力都很強，比對的清除效果顯著，在較低濃度下，清除率已經接近甚至超過BHT。

圖4 E-SDF和F-SDF對超氧陰離子()的清除能力比較

2.2 F-SDF和E-SDF的紅外光譜分析

如圖5所示，2種SDF均在3 300～3 500 cm－1內出現較強的吸收峰，此為O—H鍵的伸縮振動峰;在2 924.5 cm－1出現吸收峰，此處是甲基與亞甲基的C—H鍵的伸縮振動峰，此處E-SDF的吸收程度明顯比F-SDF高;在1 610 cm－1附近出強現吸收峰，ESDF在 1 611.46 cm－1處，F-SDF在1 606.36 cm－1處，此波動范圍為芳香環的伸縮振動;在1 100 cm－1附近出強現吸收峰，E-SDF在1 105.40 cm－1處，FSDF在1 106.70 cm－1處，此處為C-F的伸縮振動;在1 500～500 cm－1內2種 SDF的吸收峰強度略有差異，E-SDF的吸收峰略強于F-SDF。

圖5 發酵與酶解制得SDF紅外光譜對比

綜合以上條件分析得出:2種方法制得的SDF結構很形似，均可能含有酚類，芳烴類，胺類，醇類化合物［13－14］，由于含量或結合程度不同，導致它們在吸收強度上面存在差異。資料顯示多糖本身并不具有抗氧化特性，但是SDF與上述具有抗氧化能力的物質緊密結合在一起，使SDF具有了一定的抗氧化活性。初步推斷微生物發酵粗酶液中酶的種類多代謝旺盛，對與山杏果肉SDF結合的某些酚類醇類物質水解充分，故造成了其在紅外光譜中的強度差異，同時抗氧化活性較之復合酶酶解產物減弱。

3 結論

本研究表明，微生物發酵液酶解法和復合酶酶解法制備的山杏果肉可溶性膳食纖維SDF均具有一定的抗氧化活性，并且在一定范圍內隨濃度增高，其活性逐漸增強。但是評價方法不同相應的反映出其抗氧化能力略有也不同，總體來說，后者制備的SDF的抗氧化能力要略強于前者，但二者都低于天然或合成類抗氧化劑，如VC，BHT等。由于產物具有明顯的抗氧化特性，故可將其歸屬于抗氧化膳食纖維一類［15－16］。2種SDF的紅外光譜圖在吸收峰上存在一定差異初步認為是水解程度不同導致，進而也造成其抗氧化能力不同。

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