采用三硝基苯磺酸法測定乳基嬰幼兒配方奶粉中的有效賴氨酸*

李君艷，仇凱，鐘其頂，于曉瑾，丁福強，熊正河，張澤生

1(天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津，300457)2(中國食品發酵工業研究院，北京，100027)3(全國食品發酵標準化中心，北京，100027)

賴氨酸是人體的必需氨基酸之一，對提高嬰幼兒智力，中樞神經和周圍神經系統發育有重要作用［1］。嬰兒配方奶粉的蛋白質含量在0.45～0.70 g/100 kJ，碳水化合物含量在2.2 g～3.3 g/100 kJ，脂肪含量在1.05 ～1.40 g/100 kJ［2］;較大嬰兒和幼兒配方食品中蛋白質含量為0.7～1.2 g/100 kJ，脂肪含量為0.7～1.4 g/100 kJ［3］。賴氨酸有2 個氨基——α-氨基和 ε-氨基，其結構式見圖1。其中ε-氨基在嬰幼兒配方奶粉加工過程(殺菌、噴霧干燥等)和貯藏過程中能與奶粉中還原糖等成分發生美拉德反應，形成Amadori產物(乳果糖基賴氨酸)，這種物質不易被蛋白水解酶作用，影響消化，從而使部分賴氨酸變為無效賴氨酸，無法被機體有效利用［4］。有效賴氨酸不足時，可能對嬰幼兒的健康造成危害［5］，因此，嬰幼兒配方奶粉中的有效賴氨酸才具有生理意義。

圖1 賴氨酸結構式

測定有效賴氨酸的方法主要有色譜方法和化學方法。色譜方法能夠擺脫機制干擾，而且線性和重復性都比較好，但需時間長而且要有專門的設備［6］?；瘜W方法主要有FDNB(2，4-二硝基氟苯)法和TNBS(三硝基苯磺酸)法。采用FDNB法測定動物蛋白時，其有效賴氨酸的含量與蛋白質的生物價有很好的相關性。但該方法不能直接測定糖類或者還原糖含量較高的食品，因為這些物質可以與有效賴氨酸形成干擾產物，從而高估有效賴氨酸的含量。另外，在酸解過程中ε-DNP-賴氨酸的損失可能會導致低估有效賴氨酸含量。此外，FDNB方法周期較長，所用的試劑FDNB對身體有害。

蛋白質中賴氨酸的游離ε-氨基在堿性條件下與三硝基苯磺酸(TNBS)反應，生成三硝基苯蛋白質。用濃鹽酸水解以后得到ε-三硝基苯賴氨酸。用乙醚萃取除去苦味酸和過量的TNBS等，在波長415 nm下測定吸光度。用標準L-賴氨酸與三硝基苯磺酸反應生成α，ε-二硝基苯賴氨酸，在酸水解時可生成ε-TNP 賴氨酸，反應如圖 2［7］。

圖2 TNBS與蛋白質反應

TNBS法測定含有葡萄糖、乳糖以及淀粉等含糖物質中的有效賴氨酸時，由于糖類物質的存在，會發生美拉德反應褐變以及碳化，影響測定的準確性。一方面由于碳化所產生物質的產生取決于糖類的數量，還有可能會形成黑色沉淀。這些有色物質不能用乙醚萃取除去，導致影響測定結果［8］。本文通過提純分離嬰幼兒配方奶粉中的蛋白質，減少糖類對測定結果的影響，并考察了乙醚萃取量、水解時間以及樣品液與TNBS反應時間等因素對嬰幼兒配方奶粉中有效賴氨酸含量測定的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器設備

1.1.1 實驗材料

嬰幼兒配方奶粉:市售以及廠家提供，其中國內0～6月齡段樣品5種品牌，6～12月齡段樣品5種，12～24月齡段樣品5種品牌，國外0～6月齡段樣品2種品牌。

1.1.2 主要試劑及配制

主要試劑:賴氨酸標準品(純度≥99.0%，北京索萊寶科技有限公司);5%三硝基苯磺酸(簡稱TNBS，Sigma-Aldrich);三氯乙酸(分析純，天津市福晨化學試劑廠);氫氧化鈉、碳酸氫鈉、濃鹽酸、乙醚(北京化工廠)，均為分析純。

主要試劑配制:

(1)0.15 g/mL三氯乙酸(TCA)溶液:準確稱取TCA 15g，用蒸餾水定容至100 mL。

(2)0.1%三硝基苯磺酸(TNBS):0.5 mL 5%TNBS用蒸餾水定容至25 mL。

(3)賴氨酸標準溶液:準確稱取L-賴氨酸標準品10 mg用0.25%氫氧化鈉溶液溶解并定容至25 mL。

1.1.3 儀器設備

UV-2450紫外分光光度計TCC-240A，SHIMADZU Corporation;分析天平 AB204-N，TOLE DO;天平XS205，METTLER TOLEDO;水浴鍋 Thermostar-95，浙江省輕工業研究所;渦旋振蕩器WH-861，太倉市科教器材廠;Sigma-3K15臺式冷凍離心機，Sigma;HC-3518高速離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司;電熱恒溫干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理

準確稱取奶粉樣品1.0 g(精確到0.1 mg)3份，用5 mL水溶解，4℃，4 000 r/min離心10 min。取下層清液1 mL，加入1 mL蒸餾水，8 mL 0.15 g/mL TCA溶液，渦旋混勻2 min，靜置15 min，5 000 r/min離心15 min，沉淀即為蛋白質。將沉淀用0.25%氫氧化鈉溶液定容至10 mL，4℃冰箱貯存備用。

1.2.2 樣品測定

移取0.3 mL樣品提取液于具塞螺紋管中，加入0.7 mL蒸餾水，然后加入1 mL 4%NaHCO3溶液，40℃水浴10 min，冷卻至室溫，加入1 mL 0.1%TNBS溶液，40℃水浴2 h，取出冷卻至室溫，加入3 mL濃HCl搖勻封管，于烘箱中110℃水解2 h，取出冷卻至室溫，加蒸餾水定容至10 mL，渦旋振蕩混合均勻。取3 mL水解液于10 mL離心管中，加入4 mL乙醚萃取，渦旋振蕩1 min，靜置分層，用吸管除去乙醚層，再用4 mL乙醚萃取1次，用吸管吸至離液面2 mm處，60℃水浴除去殘留的乙醚，415 nm測定吸光值。同時做樣品空白，在加入TNBS溶液之前加入3 mL濃HCl，其他實驗步驟與上述步驟相同［7，9－11］。

1.2.3 標準曲線的繪制

分別吸取蒸餾水1 mL(標準品空白)、50、100、200、300、350、400 μL 標準賴氨酸溶液于具塞螺紋管中，除空白，依次加入 950、900、800、700、650、600 μL 0.25%NaOH溶液，其他操作同1.2.2。以吸光度為縱坐標，賴氨酸濃度mg/mL為橫坐標，繪制標準曲線。

1.3 蛋白質的測定

采用GB 5009.5－2010食品中蛋白質的測定方法。

2 結果與討論

2.1 前處理方法優化

由于三氯乙酸和卡氏試劑是效果較好的蛋白沉淀劑，因此分別采用三氯乙酸(TCA)和卡氏試劑對樣品進行前處理［11－13］，并進行加標實驗，計算加標回收率。

采用TCA沉淀法:準確稱取奶粉樣品0.2 g(精確到0.1 mg)，用2 mL水溶解，加入8 mL 0.15 g/mL TCA溶液，4℃ 4 000 r/min離心15 min，沉淀即為蛋白質。將沉淀用10 mL 0.25%NaOH溶解，得蛋白質溶液。

卡氏試劑法:準確稱取奶粉樣品0.2 g，用0.9 mL水溶解，加入1 mL乙腈混勻，加入50 μL CarrezI(亞鐵氰化鉀80 mmol/L)混勻，再加入50 μLCarrezII(硫酸鋅250 mmol/L)混勻，4℃，4 000 r/min離心15 min，沉淀即為蛋白質。將沉淀用 10 mL 0.25%NaOH溶解，得蛋白質溶液。

表1 兩種前處理方法結果

表2 TCA處理的樣品加標回收率

表2結果可知，使用卡氏試劑處理的樣品中并未測到樣品中含有的賴氨酸，推測可能在前處理過程中對賴氨酸造成了損傷，可見卡氏試劑并不適合樣品中賴氨酸的測定。采用TCA處理的樣品其回收率為86%。因此采用15%TCA對樣品進行前處理。

采用SDS-PAGE方法對TCA沉淀蛋白以及上清液分別進行分析。按1.2.1平行處理2份樣品，分別得到樣品沉淀和上清液。分別稱取3 mg樣品沉淀，溶于1 mL不連續電泳樣品緩沖液(0.08 mol/L Tris-HCl，pH 6.8)，上清液與緩沖液體積比1∶1。采用不連續聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為15%，電泳上樣量為10 μL，濃縮膠電壓50 V，分離膠電壓120 V(溴酚藍距離邊界1 cm停止)，電泳結束后膠片固定1h，考馬斯亮藍R250染色，40℃搖床染色4 h，染色結束后脫色至背景色無色，凝膠成像儀拍照，最后利用Bio-Rad Quantity One和SPSS統計分析軟件進行電泳圖譜分析［4］。由圖3可見，上清液中未見蛋白質，因此利用15%濃度的TCA可以完全沉淀蛋白質。

圖3 SDS-PAGE分析TCA沉淀蛋白以及上清液

表3 除去大部分脂肪后樣品的回收率

由于樣品中含有較高含量的脂肪，干擾結果的測定，因此前處理過程中使用4 000 r/min，4℃，離心10 min除去樣品中含有的大部分脂肪，并進行回收率測定實驗，回收率在85% ～120%。

2.2 參數優化

2.2.1 乙醚用量對吸光度的影響

用乙醚萃取的可溶性有色物質，包括過量的TNBS、α-TNP賴氨酸，以及水解過程中產生的苦味酸等。它們均為黃色物質，影響ε-TNP賴氨酸的測定，而且ε-TNP賴氨酸和ε-TNP肽均不溶于乙醚，只存在于水相中，因此采用乙醚作為萃取溶劑。由圖2可知，隨乙醚量的增加，萃取越徹底;當乙醚量為4、5、6 mL時吸光值達到最低且趨于平穩，選擇最佳乙醚量為4 mL。

圖4 乙醚萃取量對有效賴氨酸吸光度的影響

2.2.2 水解時間對吸光度的影響

選擇乙醚萃取量為4 mL，其他條件保持不變，改變樣品在烘箱中的水解時間 30、60、90、120、150、180 min，415 nm測定吸光值。由圖3可見，在反應初始階段，溶液的吸光度隨著時間的增加逐漸升高，水解120 min吸光值達到最大，反應時間超過120 min以后吸光值基本保持不變。在不影響吸光度的前提下，選擇最佳水解時間為120 min。

圖5 水解時間對有效賴氨酸吸光度的影響

2.2.3 樣品液與TNBS反應時間對吸光度的影響

根據上述優化條件，其他條件保持不變，改變與樣品液與TNBS的反應時間，分別在30、60、90、120、150 min測定樣品的吸光值。

圖6 樣品液與TNBS反應時間對吸光度的影響

由圖6可知，在反應的初始階段，吸光值隨樣品液與TNBS反應時間的增加而升高，當反應時間為120 min時，吸光值達到最大120 min以后，吸光值基本保持不變。選用樣品液與TNBS最佳反應時間為120 min。

2.3 方法的線性、檢出限和定量限

在賴氨酸濃度為0.02～0.12 mg/mL內，線性良好，相關系數R2=0.999 3。檢出限為3.72 μg/mL，定量限為 10.23 μg/mL。

圖7 賴氨酸標準曲線

2.4 方法回收率以及重復性

用空白樣品加標的方法計算回收率以及精密度。對同一樣品分別進行3個水平的加標，每個水平做3份平行，添加水平分別為為 0.024 48、0.048 96、0.073 44 mg/mL，平行測定3次，在相同的條件下測定吸光值?？芍?，當加標量在0.024 48～0.073 44 mg/mL時，樣品加標回收率在86% ～115%，精密度相對標準偏差RSD在0.17% ～2.34%，樣品重復性相對標準偏差RSD為1.55%～5.57%。因此該方法可以用于測定嬰幼兒配方奶粉中有效賴氨酸的含量。

2.5 樣品測定

采集國內外市場以及商家提供的不同品牌的嬰幼兒配方奶粉17個，對其有效賴氨酸含量進行測定，結果見表1。WHO/FAO(世界衛生組織和糧農組織)推薦嬰兒有效賴氨酸需求模式為0.5歲嬰兒:57 mg/g蛋白質;1～2歲嬰幼兒:52 mg/g蛋白質。膳食中氨基酸含量過高或過低均會影響蛋白質的營養質量［15］。表1樣品數據分析顯示，國內不同月齡嬰幼兒配方食品中有效賴氨酸均符合低限要求，某些樣品中有效賴氨酸的含量達96 mg/g蛋白質。正常膳食中大量加入一種氨基酸可導致動物進食量下降與嚴重的生長障礙，而大量的賴氨酸會導致腦中異亮氨酸、亮氨酸以及精氨酸耗竭［15］。

表4 國內外嬰幼兒配方奶粉中的有效賴氨酸含量 mg/g蛋白質

3 結論

本文建立了嬰幼兒配方奶粉中有效賴氨酸測定方法——三硝基苯磺酸法，采用蛋白質提純法降低糖類對有效賴氨酸含量的影響;通過單因素試驗，得到最佳乙醚萃取量為4 mL，水解時間為2 h，TNBS孵化時間為2 h。該法線性范圍0.02～0.12 mg/mL，檢測限為3.72 μg/mL ，定量限為10.23 μg/mL，重復性良好，RSD為1.55% ～5.57%，回收率為86% ～115%。對市場抽樣分析顯示，國內不同月齡嬰幼兒配方食品中有效賴氨酸均符合WHO/FAO標準低限要求，某些樣品中有效賴氨酸的含量達96 mg/g蛋白質。

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