液相色譜-質譜聯用技術在藥物分析中的應用*

戴冬艷，朱靜毅，聞琍毓

(江蘇省揚州藥品檢驗所，揚州 225009)

高效液相色譜(HPLC)是以液體作為流動相，并采用顆粒極細的高效固定相的柱色譜分離技術。高效液相的適用性廣，不受分析對象揮發性和熱穩定性的限制，因此應用范圍廣。近年來高效液相色譜法在藥物分析中占主要地位，據《美國藥典》22版記載，HPLC在含量測定方法中位居第一。

質譜(MS)是強有力的結構解析工具，能夠為結構定性提供較多的信息，是理想的色譜檢測器，不僅特異，而且具有極高的檢測靈敏度。串聯質譜法是質量分離的質譜檢測技術，在單級質譜給出化合物相對分子量的信息后，對準分子離子進行多級裂解，進而獲得豐富的化合物碎片信息，確認目標化合物，對目標化合物定量［1］。串聯質譜具有更高的選擇性和靈敏度，其檢測水平可以達到pg級。

液相色譜－質譜/串聯質譜聯用(LC－MS/MS)技術將液相高效的在線分離能力與質譜的高選擇性、高靈敏度的檢測能力相結合，可以同時得到化合物的保留時間、分子量及特征結構碎片等豐富的信息，是組分復雜樣品和微量樣品分離分析最有力的研究手段。與氣相色譜－質譜聯用(GC－MS)相比，GC－MS法對揮發性未知成分與微量成分的結構分析具有獨到之處，但是GC－MS法的應用范圍有限，因為所研究的藥物樣品必須氣化，故難以用于極性、熱不穩定和大分子化合物的測定。LC－MS不受上述限制，且分析前樣品預處理簡單，一般無需衍生化或水解，這使得LC－MS聯用技術具有更廣闊的應用前景。近年來，LC－MS聯用技術應用越來越廣泛，在藥物及其代謝產物的定性和定量研究中發揮了極其重要的作用，本文綜述了近年來LC－MS聯用技術在藥物分析中的應用。

1 液質聯用儀器

液質聯用儀主要由液相色譜儀、質譜儀、離子源組成。離子源即“接口”技術，就是將高流量的液相色譜和高真空的質譜體系進行“聯用”，將欲分析的樣品電離，得到帶有樣品信息的離子，使其進入質譜的真空系統，這一度曾是液質聯用技術發展的“瓶頸”。一直到電噴霧技術和大氣壓化學電離技術的完善成熟，液質聯用技術才得到快速的發展。當前使用廣泛的接口技術有:熱噴霧(TSP)、等離子體噴霧(PSP)、粒子束(LINC)、大氣壓電離(API)和動態快原子轟擊(FAB)［2］。API主要包括電噴霧離子化(ESI)、離子噴霧離子化(ISI)和大氣壓化學離子化(APCI)3種模式。這3種的共同點是樣品的離子化在處于大氣壓下的離子化室內完成，離子化效率高，大大增強了分析的靈敏度和穩定性。質譜分析器是液質聯用的核心，是確保儀器具有高靈敏性、高準確性、高選擇性、分析檢測范圍寬等強大功能的重要部分。液質聯用儀中常用的質譜包括串聯四級桿、離子阱、四級桿－飛行時間質譜等。這些質譜各有特點，結合同位素標記等技術，在藥物分析領域發揮重要作用。

2 在藥物成分分析中的應用

LC－MS不僅具有足夠的靈敏度選擇性，同時還能夠給出一定的結構信息，分析快速而且方便，為藥物鑒定提供了一種更高效、更有效的方法。

2.1 天然藥物成分分析 中藥藥物成分復雜多樣，定性分析方劑成分是一項復雜且耗時的工作。液質聯用技術在對中藥成分分析時，液相色譜對各成分進行在線分離，質譜檢測器可以給出大量的結構信息，可對未知成分進行直接分析;且樣品不需要進行煩瑣和復雜的處理，因此在中藥成分分析中得到廣泛應用。

侯鵬飛等［3］采用液質聯用(HPLC－ESI－TOF/MS)技術分析了延胡索中的生物堿類成分，以ESI－MS獲得的準分子離子峰確定化合物分子量，結合紫外光譜、HPLC的保留時間等信息鑒定了延胡索中的11個生物堿類成分。薛長暉［4］采用液質聯用法對山西苦蕎中的黃酮類化合物進行分離鑒定，發現山西靈丘地區產的苦蕎提取液中黃酮類化合物以蘆丁為主，并分離出5種黃酮類化合物。

2.2 抗生素成分分析 許多抗生素品種由于其產生菌絕大多數都是產生結構相似的多組分復合物，用常規分析方法對其進行快速鑒別和相關物質分析比較困難，藥品質量難以控制。液質聯用技術以其強有力的分離和分析能力，在這類抗生素藥物成分分析和相關物質的鑒定上顯示了巨大優勢。

馬鳳余等［5］應用高效液相色譜－串聯質譜技術快速鑒定頭孢地嗪中異構體雜質的方法。在所建立的色譜條件下，頭孢地嗪及其異構體雜質獲得有效分離，并通過串聯ESI質譜在線檢測，獲得相關的色譜和質譜信息，結果鑒定出頭孢地嗪熱降解的異構體雜質為反式異構體及Δ3異構體。Min Hu等［6］應用LC－MS技術鑒定了十六環大環內酯抗生素。

2.3 中成藥、保健品、食品中非法添加化學藥物成分的鑒定分析 近年來，一些不法商人為牟取暴利，在中成藥、保健品和食品中非法添加化學藥物，患者在不知情的情況下大量服用，可能造成嚴重的不良反應，嚴重威脅到人類健康。液質聯用技術以其靈敏度高的優點，越來越多地應用到非法添加藥物成分的鑒別中，成為打假治劣的一把利劍。

2.3.1 中藥制劑中非法添加化學藥物成分 目前中藥制劑中非法摻入化學藥物成分且同時摻入多種低濃度化合物是新動態之一?？癸L濕類中藥多數顯效慢，需長期服用，但安全性高;西藥非甾體抗炎藥中絕大多數兼有抗風濕作用，此外糖皮質激素類亦具有抗風濕及類風濕作用。這些西藥的共同特點是療效迅速，但長期服用副作用大，嚴重的可危及患者生命。采用液質聯用技術，結合相對分子量一級二級質譜碎片，可準確快速地判斷中藥制劑中是否摻入阿司匹林、氨基比林、布洛芬、雙氯芬酸鈉、吲哚美辛這些西藥［7］。來國防等［8］采用液質聯用法檢測補腎壯陽類中藥制劑中非法添加的化學成分西地那非和他迭拉非，此法靈敏準確，可用于補腎壯陽類中藥制劑的質量檢驗。伴隨人們飲食習慣的改變，糖尿病的發病率呈上升趨勢，因此降糖類中藥制劑需求日益增大。但一些不法分子擅自在中成藥中摻入化學降糖藥，對患者的健康及生命安全造成了重大危害。李曉燕等［9］應用液質聯用技術建立了降糖類中成藥中非法添加降糖化學成分的快速定性方法，此法能同時鑒別降糖中藥中是否添加鹽酸二甲雙胍、鹽酸苯乙雙胍、格列吡嗪、鹽酸吡格列酮、格列齊特、格列本脲、格列美脲7種化學藥品。

2.3.2 保健食品中非法添加化學藥物成分 近年來，隨著生活水平的提高，保健品進入到更多的家庭中去。但是不法分子為了突顯療效，在保健品中加入化學成分的現象非常普遍。崔福春等［10］應用 LCMS/MS法建立了安神類保健品中非法添加21種化學成分的快速測定方法，該方法采用多反應監測的方式檢測，干擾少，靈敏度高，檢測結果更準確。閆韶華［11］應用液質聯用儀建立了保健食品中非法添加藥物——茶堿成分定性定量的方法，該方法可用于保健食品中非法添加藥品茶堿成分的測定和確定。關日晴等［12］應用液質聯用技術建立了保健品中非法添加的6種腎上腺皮質激素的檢驗方法，該方法可同時對《中國藥典》收載的醋酸地塞米松、醋酸可的松、醋酸氫化可的松、醋酸潑尼松、醋酸潑尼松龍和倍他米松6種常用口服腎上腺皮質激素進行檢查，準確率達到100%。

2.3.3 食品中非法添加化學藥物成分 河南省部分地區“瘦肉精”事件曝光后，引起國家各級部門高度重視，也使廣大人民群眾對食品安全的問題極為關注。引起人體中毒的“瘦肉精”主要是β－腎上腺素興奮劑中的克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇。王秀穎等［13］建立了高效液相色譜－串聯質譜同時檢測豬肉中克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇殘留的方法，本法能快速、高靈敏、同步檢測出這3種化學成分。液質聯用對于檢測禁用和限用的食品添加劑具有顯著優勢，還可以大大提高工作效率，能滿足食品衛生學評價的要求，具有較強的實用價值。

3 在藥物含量測定中的應用

藥物含量測定是藥物分析中主要的一個方面，液質聯用技術對于成分復雜、微量藥物定量具有優勢，因此在中藥含量測定和藥物殘留測定時應用廣泛。

3.1 在藥物成分含量測定中的應用 嚴志宏等［14］采用LC－MS/MS法，建立了金櫻子中熊果酸和齊墩果酸的含量測定方法。該法測定的熊果酸和齊墩果酸的平均加樣回收率分別為98.1%(RSD為2.7%)和97.6%(RSD 為2.9%)，方法快速簡便，靈敏度高，重現性好，可用于金櫻子的質量控制。中成藥附子理中丸具有溫和健脾等功能，但其有效成分雙酯型生物堿毒性很強，因此對含有附子的藥品中雙酯型生物堿的檢測和控制就非常重要。索志榮等［15］采用LC－MS測定附子理中丸中3種雙酯型生物堿——新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿的含量，結果新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿平均回收率分別為98.7%(RSD為2.9%)、98.6%(RSD 為3.0%)和 98.1%(RSD 為 3.2%)，為評價和控制附子理中丸的質量提供了科學依據。

3.2 在藥物殘留測定上的應用 液質聯用技術出現以前，殘留藥物由于其含量低，檢測方法落后，因此沒有引起人們的重視。液質聯用技術具有選擇性好、靈敏度高等優點，是微量和痕量成分檢測很有效的方法，被廣泛應用于藥物殘留的測定上。于慧娟等［16］采用HPLC/MS/MS建立了分析魚體中氯丙嗪殘留的方法，適合于魚類樣品中氯丙嗪的殘留檢測。田艷玲等［17］采用液相色譜－串聯三重四級桿質譜法測定牛奶中的氯霉素殘留量。程樸［18］經過試驗，建立了一種靈敏度高、結果可靠性高的液相色譜質譜聯用分析法測定馬鈴薯樣品中的喔草酯殘留量。該方法殘留測定最小檢出量為2×10－8g，符合一般農藥殘留分析要求。液質聯用技術由于其自身特點，在藥物殘留檢測上具有廣闊的前景，對于控制食品、藥品質量意義重大。

4 在藥代動力學、藥物代謝學中的應用

液質聯用技術在分析藥物及其在各種復雜生物體基質(全血、血漿、尿、膽汁及生物組織)中的代謝產物時，由于其選擇性強、靈敏度高，不僅可以避免復雜、煩瑣、耗時的樣品前處理工作，而且能分離、鑒定難于辨識的痕量藥物代謝產物，尤其是串聯質譜的應用，通過多反應檢測(MRM)，可以提高分析的專一性，改善信噪比，提高靈敏度，從而快速方便地解決問題。

4.1 在藥代動力學研究中的應用 人體(或動物)在接受藥物后，藥物經吸收、分布、代謝、排泄等過程，在體液中有濃度低、代謝復雜且代謝產物多等特點。通過應用液質聯用技術可建立簡便靈敏的體內分析方法，為該藥在人體內的藥代動力學研究提供一種可靠的檢測手段。

譚志榮等［19］利用高效液相色譜－質譜檢測方法，研究普伐他汀的人體藥動學。血漿樣品經固相萃取，以Thermo Hypurity C18柱為色譜柱，流動相為乙腈－0.2%甲酸水溶液(85∶15)，流速為 0.2 m l/min;采用ESI正離子方式進行檢測。結果普伐他汀在2.52～660μg/L范圍內線性關系良好;絕對回收率均在70%以上，相對回收率為98% ～102%，日內、日間 RSD均＜15%，可用于普伐他汀血藥濃度檢測和藥動學研究。趙恒利［20］等建立LC－MS/MS法測定人血漿中氯馬斯汀的濃度，該方法操作簡便，分析周期短，定量限可達0.01 ng/ml，可用于氯馬斯汀口服給藥的藥代動力學和生物等效性研究。

4.2 在藥物代謝研究中的應用 國內外多有采用LC－MS法進行藥物代謝研究，不僅可以避免復雜的分離純化代謝物樣品，而且能分離鑒定難于辨識的痕量代謝產物，可以大大提高分析的專一性和靈敏度。

近年來在藥物研究中用LC－MS/MS進行高通量生物分析的發展，應用快速液相萃取，高效毛細管的LC－MS/MS，檢測多種藥物血中、尿中的藥物原型及其代謝產物［21］。徐友宣等［22］研究沙美特羅在小鼠體內的代謝過程，尿樣經固相提取后用LC－MS－MS分析，根據代謝知識和陽性尿的響應數據，得出了沙美特羅的原型和四種代謝產物——羥基沙美特羅、羥基－甲氧基－沙美特羅、羰基－沙美特羅、羰基－羥基沙美特羅，從而推測沙美特羅可能的主要代謝途徑為羰基化、甲基化以及兩者的結合。趙宇峰等［23］采用人腸內細菌和烏頭堿體外溫孵的方法，探討烏頭堿的代謝產物16－O－去甲基去氧烏頭堿在人腸內的生物轉化。利用ESIMS/MS方法直接分析16－O－去甲基去氧烏頭堿的代謝產物，烏頭類生物堿在ESI正離子模式下形成質子化分子，結果成功檢測并鑒定了16－O－去甲基去氧烏頭堿被人腸內細菌轉化，通過脫乙?；?、脫苯甲?；?、脫甲基、脫羥基以及酯化反應產生新型的單酯型、雙酯型和脂類生物堿等10余種代謝產物。

總之，液質聯用技術應用于藥物及其代謝產物研究是該技術在醫藥領域應用最廣泛、研究論文報道最多的領域。液相色譜與串聯質譜聯用顯示了獨特的優勢，代表了藥物代謝研究的發展趨勢。

近年來，液相色譜－質譜聯用在技術及應用方面取得了很大進展，在藥物分析領域應用越來越廣泛，且在生物大分子分析(如在蛋白質分離和鑒定上應用)和臨床診斷中都發揮重要作用［24］。隨著現代化高新技術的不斷發展及液相色譜－質譜聯用技術自身的優點，液相色譜－質譜聯用技術必將在未來幾年不斷發展且在藥物分析中發揮越來越重要的作用。

1 李忠紅，王玉，倪坤儀.LC－MS在藥物分析中的應用.藥物分析雜志，2004，24(3):341

2 BiH，Hoffman K L，Pace G ，etal.Mixed－mechanism ionization to enhance sensitivity inatomospheric pressure ionization LC/MS.J Pharein Biomed Anal，2000，22(5):861

3 侯鵬飛，宿樹蘭，段金傲，等.液質聯用技術分析延胡索中的生物堿類成分.中國醫藥導報，2008，5(11):48

4 薛長暉.液質聯用分離測定山西苦蕎黃酮.食品研究與開發，2009，30(1):103

5 馬鳳余，吳強，衛強.LC－MS分離鑒定頭孢地嗪熱降解的異構體雜質.藥物分析雜志，2011，31(9):1833

6 Min Hu，Chang Qinhu.Identification of the components of 16－membered macrolide antibiotics by LC/MS.Analytica Chimica Acta，2005，535:89

7 來國防，程賓，魯靜.液相色譜－質譜聯用測定抗風濕類中藥中非法添加化學藥物成分.時珍國醫國藥，2010，21(4):847

8 來國防，程賓，王梅.補腎壯陽類中藥制劑中非法添加化學藥物成分的檢測.中國藥學，2010，19(22):32

9 李曉燕，劉斐，鄭靜，等.液質聯用檢查降糖中藥制劑中摻入的7種化學藥品.中國藥事，2008，22(11):980

10 崔福春，郭春，李丹.LC－MS/MS法快速測定安神類中成藥、保健食品中非法添加的21種化學成分.中國當代醫藥，2009，16(25):8

11 閆韶華.液質聯用儀在鑒別保健食品中茶堿成分的應用.數理醫藥學雜志，2010，23(4):480

12 關日晴，劉敏敏，李晨輝.液質聯用法檢測中成藥和保健品食品中的6種腎上腺皮質激素.廣東藥學院學報，2011，27(2):151

13 王秀穎，許永國，周大慶，等.液相色譜/串聯質譜法檢測豬肉中三種化學物質的殘留試驗.山東畜牧獸醫，2011，32:9

14 嚴志宏，萬彥婷，盧珂，等.液質聯用法測定金櫻子中熊果酸和齊墩果酸的含量.江西中醫學院學報，2010，22(6):43

15 索志榮，徐敏，秦海燕，等.LC－MS測定附子理中丸中3種雙酯型生物堿含量.藥物分析雜志，2010，30(12):2279

16 于慧娟，王慶賀，戚雋淵，等.同位素稀釋液質聯用法測定魚體中氯丙嗪的殘留.海洋漁業，2011，33(1):83

17 田艷玲，王浩.液相色譜－串聯三重四極桿質譜測定牛奶中的氯霉素殘留量.食品研究與開發，2011，32(3):125

18 程樸.液質聯用法測定喔草酯在馬鈴薯中的殘留.現代農藥，2010，9(6):35

19 譚志榮，歐陽冬生，周淦，等.簡單靈敏的LC－MS/MS方法檢測人血漿中普伐他汀的濃度.中國新藥雜志，2008，17(13):1150

20 趙恒利，王海生，常堃，等.LC－MS/MS法測定人血漿中氯馬斯汀濃度.藥物分析雜志，2011，31(8):1440

21 Jemal M.High－throughput quantitative bioanalysis by LC－MS/MS.Biomedical Chromatography，2000，14(6):422

22 徐友宣，秦旸，劉欣，等.小鼠尿中沙美特羅及其代謝物的LC/MS研究.質譜學報，2006，24(3):417

23 趙宇峰，宋鳳瑞，越皓，等.16－O－去甲基去氧烏頭堿在腸內細菌中的生物轉化研究.分析化學，2007，35(12):1711

24 李衛中，馬燕.液質聯用技術在醫藥領域的發展與應用.現代食品與藥品雜志，2007，17(6):66