芽孢桿菌誘變育種研究進展

楊麗麗，尹寶華，侯文菊，石慧清

（山西舜天農業微生物科學技術研究院，山西陽泉045000）

芽孢桿菌（Bacillus）是一類好氧或兼性厭氧、在一定條件下能產生抗逆性內生孢子的有機化能異養菌。它們在自然界分布非常廣泛，生理特性豐富多樣，主要存在于土壤、植物體表面及水體中，由于它們能夠產生對熱、紫外線、電磁輻射和某些化學藥品有很強抗性的芽孢，能忍受多種不良環境[1]，因此，芽孢桿菌在醫學、農業、工業和環境污染治理等領域被廣泛應用。

微生物菌種在自然條件下發生突變的概率較低，且突變幅度也不大，基因結構一般很難發生改變。因此，單純依賴微生物群體的自然突變來選育特異性菌株遠不能滿足生產和研究需要。隨著生命科學的發展以及學科交叉的深入，誘變育種技術得到不斷發展和創新，從而為篩選更多高效菌種提供了技術上的可能和便利。

誘變育種是以誘變劑誘發基因突變，通過篩選突變體，尋找正向突變菌株的一種誘變方法[1]。該技術突變率高，在較短時間內能獲得更多的優良變異類型，且誘變手段多樣、操作簡便。因此，是實驗室研究及工業生產中最常采用的優良菌株選育方式。目前，物理誘變、化學誘變和生物誘變是3種常見的誘變方法。目前，國內還未見有關芽孢桿菌的綜述性研究報道。

本文綜述了國內近年來應用于芽孢桿菌的誘變育種技術，旨在為芽孢桿菌高效誘變育種提供理論依據。

1 物理誘變育種

目前，發現的主要物理誘變方法有X射線、紫外線、γ射線、α射線、β射線、中子、超聲波、激光、宇宙射線和離子輻照誘變育種等[2-3]。

1.1 紫外線誘變技術

紫外線誘變技術是誘變和篩選優良菌株的常規育種方法。紫外線專一性作用于嘧啶，主要使相鄰的嘧啶堿基尤其是胸腺嘧啶之間發生共價結合，形成的嘧啶二聚體會阻礙堿基間的正常配對，導致突變甚至死亡[4]。因紫外誘變技術具有設備簡單、誘變效率高、操作安全簡便等優點而被廣泛應用。

因菌種差異，紫外線對各種微生物的誘變效應截然不同。通常情況下，經紫外照射3～5 min即可使微生物營養體致死，但芽孢桿菌較特殊，約需10 min。另外，可見光修復是微生物紫外誘變后不容忽視的問題。一般為降低可見光的修復率，可在誘變后冰浴2 h或暗培養1 d。利用紫外誘變已選育出了大量優良微生物菌種[5]。

高淑紅等[6]用紫外誘變育種方法，由枯草芽孢桿菌D-2誘變得到遺傳穩定性良好的莽草酸缺陷型突變株D-202。其在2 t發酵罐中發酵單位可達到50 g/L。肖湘政等[7]用紫外線誘變膠質芽孢桿菌HM8841，誘變出了發酵周期短、抗逆性強的菌株。王洲等[8]采用紫外線對產α-ALDC的枯草芽孢桿菌進行誘變，得到2株比原菌株酶活分別提高107.62%和162.25%的菌株。張智等[9]對枯草芽孢桿菌Ls-02進行紫外誘變，選育出1株遺傳性穩定的枯草芽孢桿菌Ls-02-45。

1.2 激光誘變技術

激光因具有操作簡單、安全、變異率高、輻射損傷輕等特點，在工業微生物育種中得到廣泛應用[2]。生物有機體直接或間接地受到激光輻射產生的光、熱、壓力和電磁場效應綜合作用的影響，引起了細胞染色體畸變、酶的激活或鈍化、細胞分裂和細胞代謝活動的改變。細胞內含物中的任何物質一旦發生改變，都可能導致生物有機體在細胞學和遺傳學特性上發生變異[4]。同種生物有機體被不同種類激光輻射后，會表現出不同的細胞學和遺傳學變化，這為生物誘變育種提供了有利條件[5]。黃建新等[10]發現，He-Ne激光對產α-乙酸乳酸脫羧酶的地衣芽孢桿菌具有明顯的誘變作用，在合適的照射劑量下，使其產酶能力比原菌株提高了2倍以上。

1.3 微波誘變技術

微波是一種具有波動性和高頻性的電磁波[5]，它與生物組織的相互作用主要表現為熱效應和非熱效應，能刺激水、蛋白質、核酸、脂肪和碳水化合物等極性分子快速振動。這種振動引起的摩擦能夠對氫鍵、疏水鍵和范德華力產生作用，使DNA結構發生變化，導致遺傳變異。微波誘變設備簡單、方法易行、操作安全，誘變效果比傳統的誘變方法好，在工業微生物菌種選育中具有較大的應用價值。顏賢仔等[11]研究表明，通過微波誘變技術對產淀粉酶的枯草芽孢桿菌7658進行誘變，可以有效改善其產淀粉酶的能力。

1.4 γ射線誘變技術

γ射線高能量產生的電離作用，可直接氧化脫氧核糖的堿基或脫氧核糖的化學鍵，間接使水或有機分子產生自由基，導致DNA損傷，造成基因突變，還可引起染色體斷裂、倒位、缺失和易位等畸變，從而改變微生物遺傳性狀[4]。該誘變技術不但能獲得高突變率和寬突變譜，而且還有利于新突變型的篩選。但γ射線有一定的局限性，操作要求較高，且有一定的危險性，通常在不能使用其他誘變劑進行誘變育種時才使用。索晨等[12]利用60Coγ射線對1株產γ-聚谷氨酸的地衣芽孢桿菌進行誘變，篩選得到1株高產突變株Bacillus licheniformis S16。

1.5 離子注入誘變技術

離子注入誘變技術具有高線性能量轉換值、集束性好、射程可控等優點，因此，其具有突變率較高、突變譜廣、死亡率低、正突變率高、性狀穩定等特點，是一種很有潛力的誘變選育新方法。近幾年，離子注入誘變技術發展非常迅速，應用普及較快，尤其在微生物改良、選育優良工業微生物菌株方面不僅帶來可觀的經濟效益，而且帶來巨大的社會效益。陳志誼等[13]利用不同劑量N+對枯草芽孢桿菌生防菌B-916進行離子注入處理，獲得了拮抗能力比原菌株提高10%以上，且遺傳性較穩定的突變菌株。

2 化學誘變育種

化學誘變是指利用一些化學物質提高生物的自然突變率?；瘜W誘變具有突變率高，位點特異性強；對處理材料損傷輕，染色體畸變比例少，極少有致死型發生；價格便宜，操作簡單，不需要特殊設備等特點。烷化劑是芽孢桿菌誘變育種中最常使用的誘變劑[5]。烷化劑具有一個或多個易取代DNA分子中活潑氫原子的活性烷基，能夠烷化DNA分子上的堿基及部分磷酸，使得DNA復制時常發生堿基配對錯誤而引起突變[2]。常用的烷化劑有亞硝基胍、乙基硫酸甲烷、硫酸二乙酯、乙烯亞胺等。有研究表明，對多黏類芽孢桿菌進行亞硝基胍誘變后，獲得比原菌株提高106%發酵單位的菌株[14]。孫金鳳等[15]用1株殼聚糖酶活較高的芽孢桿菌菌株，經硫酸二乙酯（DES）誘變處理50 min后，篩選得到殼聚糖酶活明顯提高的突變株DES-4，其殼聚糖酶活為26.7 nkat/mL，是原菌株的2.7倍。

3 生物誘變育種

目前，按誘變方式可將生物誘變劑分為3大類：轉導誘發突變、轉化誘發突變和轉座誘發突變[2]。其中，應用最廣泛的是轉座誘發突變。王玉飛等[16]用含轉座子Tn917的質粒pLTV3轉化炭疽桿菌，對2 000個突變體進行了篩選，從中得到6株芽孢形成缺陷型突變株。

4 復合誘變育種

微生物突變機制復雜，單一誘變往往難以達到預期目的。因此，誘變育種往往采用組合2種或2種以上化學或其他誘變劑的育種方法，即復合誘變，其具有協同效應。2種或多種誘變劑的先后使用、同一種誘變劑的重復作用、2種或多種誘變劑的同時使用都較單一誘變效果好[17]。尹明浩等[18]采用紫外-硫酸二乙酯復合誘變的方法，選育出1株高產3-羥基丁酮的枯草芽孢桿菌。張敏等[19]對枯草芽孢桿菌515菌株進行紫外線、氯化鋰、硫酸二乙酯的復合誘變，獲得了1株遺傳穩定性高的產幾丁質酶的活性菌株。李欣等[20]利用紫外線照射和快中子輻射相結合的方法，對地衣芽孢桿菌進行誘變，獲得1株搖瓶效價較原菌株提高23%的突變株B-55。

5 小結與展望

綜上所述，關于芽孢桿菌誘變育種的方法多種多樣，但具體的芽孢桿菌誘變育種還存在不少問題。由于單一的手段往往難以誘變得到活性較高的菌株，在生產中就要運用各種復合誘變技術對其誘變，以獲得優良菌種。

隨著經濟的發展、科研水平的提高，芽孢桿菌與人們的日常生活更為密切，它作為一種十分重要的工業微生物菌種，越來越引起人們的普遍關注和青睞。目前，芽孢桿菌在農作物病害防治、飼料加工、環境治理等方面的研究還處于起步階段，具有廣闊的發展前景。隨著現代生物技術的不斷發展以及對誘變育種技術的深入研究，把分子生物學技術應用于芽孢桿菌的研究，也將成為熱點。芽孢桿菌誘變育種豐富和拓寬了菌種的變異類型，尤其是自然界少有的性狀變異，增加了可利用的基因資源，也使誘變篩選效率得到進一步提高。

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