血管內栓塞大腦中動脈制作非人靈長類卒中慢性期模型的研究①

王強，張通，趙春禹，徐建民，溫枚，裴志勝

·專題·

血管內栓塞大腦中動脈制作非人靈長類卒中慢性期模型的研究①

王強1,2a，張通1,2a，趙春禹1,2a，徐建民1,2b，溫枚1,2c，裴志勝1,2c

目的建立非人靈長類腦梗死慢性期動物模型。方法雄性成年恒河猴10只，血管內介入栓塞動物利手對側大腦中動脈。依栓塞節段不同，分為M 1段栓塞組(n=3)、上干栓塞組(n=5)和下干栓塞組(n=2)。通過標準神經量表和小槽食丸取回任務評定運動功能。結果M 1段栓塞組均在急性期死亡。上干栓塞組均存活，MRI可見梗死灶，急性期一側肢體癱瘓，其中4只功能障礙在慢性期持續存在，另外1只運動功能恢復。下干栓塞組急性期一側肢體癱瘓，運動缺陷恢復迅速且完全。結論大腦中動脈上干栓塞動物模型存活率高，慢性期存在運動功能障礙，適合于慢性期研究。

腦梗死；慢性期；非人靈長類；動物模型；血管內栓塞

[本文著錄格式]王強，張通，趙春禹，等.血管內栓塞大腦中動脈制作非人靈長類卒中慢性期模型的研究[J].中國康復理論與實踐,2012,18(5):401-405.

腦卒中是目前成人致殘的主要原因[1]?，F有的方法在腦卒中慢性期(平臺期)治療效果一直不明顯。盡管細胞移植[2]、腦刺激[3]及強制誘導運動治療[4]等有望提高療效，但其療效及促進運動功能恢復的潛在機制尚待研究。而理想的腦卒中慢性期動物模型是進行實驗研究的基礎[5]。

雖然嚙齒類已被廣泛用來制備腦缺血模型[6]，但是非人靈長類的神經環路、腦血管系統、灰/白質比與人類更加相似[7]，而且可像人類一樣使用手臂完成復雜的運動任務。因此在研究神經生理和神經解剖機制方面，非人靈長類模型越來越受重視。

目前靈長類動物卒中模型多為急性期腦缺血模型[8-9]。成功的卒中慢性期模型只有顱骨切開后直接電凝切除大腦中動脈法。然而這種方法手術難度高，對動物創傷大，不宜推廣[10-11]。

血管內介入栓塞法是一種微創技術，可避免開顱、局部腦組織損傷等問題，近年來已被用于非人靈長類腦缺血/再灌注模型的制備[12-14]。此法主要用于急性期病理生理改變和治療效果的研究，而急性期后動物的功能缺陷是否長期存在、閉塞大腦中動脈(m iddle cerebral artery,MCA)哪個節段或分支最理想尚需深入研究。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 健康清潔級成年雄性恒河猴10只，平均年齡(9.3±0.4)歲，體質量(9.5±0.3)kg，由中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供，經北京市園林綠化局野生動物保護站批準使用。所有動物體格健康，術前1個月引入，頭顱MRI檢查無異常。

1.2 模型的制備 所有動物術前禁食24 h，肌注氯氨酮15mg/kg誘導麻醉，氯氨酮100mg、地西泮10mg加入生理鹽水中緩慢靜點維持動物處于穩定的麻醉狀態，硫酸阿托品0.2mg肌注減少唾液分泌，肝素鈉500 U加入生理鹽水500m l靜點使全身肝素化，尼莫地平10mg/h持續靜脈泵入預防術中腦血管痙攣。監測心率、呼吸、血壓及血氧飽和度。

動物仰臥于手術臺上，以Seldinger法[14]穿刺右側股動脈，經股動脈置入4F動脈鞘及指引導管(Cordis Neurovascular公司)，將指引導管送至利手對側頸內動脈頸2水平，造影(TOSHIBA數字減影血管造影X線機，KXD-1250A；日本東芝公司)獲得路徑圖，導管與導絲在路徑圖下互相配合，超選至MCAM 1段，二維或三維血管造影獲得工作角度，通過造影證實供血范圍，釋放彈簧圈(Cordis Neurovascular公司)；或導絲繼續超選至M 1段末端上干入口處，或下干入口處，通過造影證實供血范圍后，選擇1 cm手術縫線，在導絲導引下緩慢釋放線段，使其進入上干或者下干，重復釋放4～5條。造影確認栓塞血管供血區不顯影，撤管至頸內動脈再次造影，除栓塞的血管外其余動脈顯影良好(圖1)。撤管，壓迫止血后加壓包扎。

圖1 MCA上干栓塞前后數字減影血管造影影像

1.3 術后護理 監護室保持安靜，室溫保持在25℃～30℃。術后5 d密切觀察意識、精神狀態、瞳孔、生命體征、出血量，每12小時行頭顱MRI掃描以觀察病灶進展及腦水腫情況。根據腦水腫情況，每次給予甘露醇0.5 g/kg緩慢靜注。靜滴青霉素以預防感染。禁食，經靜脈補液提供能量。5 d后予流食及軟食，逐步過渡到固體飼料。之后動物的活動逐漸增多，送回大籠飼養。

1.4 神經功能評定 采用標準神經量表[15]評價，內容包括運動功能、行為警覺水平和顱神經缺陷，總分100分。評定由2名觀察者獨立完成，每次評定于30 m in內完成。分別于術后1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、2 d、3 d、5 d、7 d、14 d、1個月、2個月、3個月、4個月進行。從術后第3周起進入自然恢復期，每天至少觀察動物患側肢體的自然使用情況30m in，每周進行小槽食丸取回任務評價1次，至少觀察到20周。

1.5 MRI 術前，術后1 d、3 d、7 d、14 d、4周、20周分別行頭顱MRI掃描。1.5 T，層厚5mm。

1.6 運動功能測試 應用小槽食丸取回任務進行前肢運動功能評價并確定利手[16]。自制食槽：根據恒河猴手指直徑在矩形的樹脂玻璃板鑿刻5個盛放食物丸的小槽，1號～5號小槽的直徑依次是14 mm、16 mm、18 mm、24 mm、30 mm，深度依次是12 mm、13 mm、14mm、16mm、18mm，兩槽間隔1 cm；猴籠與食槽間放置帶矩形孔的有機透明玻璃板，玻璃板分3種，孔分別位于中間及兩側，孔的大小足以使猴伸出一側前肢；食槽放置在籠外正對孔的位置。動物一側上肢必須通過孔才能從籠外的小槽中取回食物。通過使用一側帶孔的玻璃板可單獨評價該側手的靈活性，通過使用中間帶孔的玻璃板可確定利手。食物丸為圓形顆粒，直徑6mm，質量約30mg，由中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供，隨機發放(10次/槽)，測試參數包括從小槽取回食物丸所需的平均時間、取回食物丸的成功率。

1.7統計學分析 使用SPSS 13.0軟件進行統計學分析，數據用(±s)表示，兩組間比較采用t檢驗，顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 一般情況 依據栓塞節段不同分為3組：上干栓塞組(n=5)、M 1段栓塞組(n=3)和下干栓塞組(n=2)。M 1段栓塞組3只動物均于術后38～62 h死亡，通過影像和解剖分析，死因為腦水腫、腦疝。上干栓塞組的5只動物和下干栓塞組的2只動物均存活。

2.2 影像學改變 MRI掃描證實腦缺血灶存在。術后24 h，上干栓塞組動物MRI顯示一側額頂葉皮質包括小部分白質在內的長T1、長T2、高彌散信號病灶；M 1段栓塞組動物MRI顯示一側額顳頂葉包括基底節在內的大面積長T1、長T2、高彌散信號病灶；下干栓塞組動物MRI顯示一側顳葉的長T1、長T2、高彌散信號病灶。隨著時間延長，上、下干栓塞組彌散信號逐漸減弱，病灶面積逐漸縮小，20周時，上干栓塞組顯示右側額頂葉皮質較小面積的長T1、長T2信號病灶。(圖2)。

圖2 栓塞后MRI影像

2.3 神經功能變化 上干栓塞組：術后1～3 h處于昏睡或嗜睡狀態，捏足指后能引起退縮反應；3～6 h，意識較前清醒，能注視檢查者，坐位保持困難，需要倚靠，患側上肢松弛、癱瘓；6～24 h，逃避反應較前靈敏，坐位保持較前好轉，精神狀態較差，活動少；1～2 d，警覺性增強，主動攻擊增多，動作較迅速，可坐位轉圈，但不能爬行；2～3 d，患側上臂能擺動，肘能屈伸，但手仍完全癱瘓，爬行易向患側跌倒；3～5 d，能四肢爬行，患側上肢活動較前靈活，能抗重力抬起，患手感覺遲鈍，手掌可屈曲但手指不能屈曲；用患手取食時，上臂可伸出，但是手笨拙不能抓握，感覺不靈敏，食物會跌落；5～7 d，四肢爬行基本正常，體力逐漸恢復，患手出現抓握，能配合健手捧水果，但笨拙，患手單獨取食失??；7～14 d，大部分動作(如爬、攀援等)基本恢復，但患手對指不能，抓握球形物體困難，感覺仍遲鈍，用患側手拿食物時掉落，其中1只在14 d內患側手可獨自熟練地取食，運動功能恢復正常。其余4只動物運動缺陷持續存在。

M 1段栓塞組：動物在術后前24 h內表現同上干栓塞組，但24 h后精神狀態及對外界刺激反應越來越差，于38～62 h死亡。

下干栓塞組：動物術后恢復良好迅速，術后7 d所有功能都恢復正常，患側肢體同前一樣是利手。

急性期神經功能評分：M 1段栓塞組術后神經功能評分迅速降低，動物于3 d內死亡；上干栓塞組腦栓塞后評分逐漸增高，14 d左右神經功能達到穩定狀態；下干栓塞組栓塞后評分迅速增高，7 d神經功能完全恢復。見表1。

表1 動物栓塞前后神經功能評分變化

2.4 恢復期和慢性期運動功能的評價 4個月后，如果動物患側的運動功能連續2周不顯示進步，則說明進入慢性期(平臺期)[17]。

栓塞前，動物的利手均能從小槽中迅速成功地取食。術后第14天，上干栓塞組中4只動物患手對指不能，感覺遲鈍，動作笨拙等功能缺陷持續存在，一直到20周動物都不能使用患側手完成小槽食丸取回任務，取食完全依靠健手，利手發生轉換。下干栓塞組所有動物和上干栓塞組1只動物從第14天起均可熟練地使用患手取食，取食速度及成功率與術前無顯著性差異(P＞0.05)。

3 討論

非人靈長類局限性腦缺血模型制備研究已經有40年的歷史，制備方法包括經眶手術法[18-21]、開顱手術法[10-11,22]、自體血凝塊栓塞法[23-26]、內皮素-1誘導法[27]和線栓法[28]。但由于動物個體間變異大，模型一致性和可重復性差；而且這些模型都主要用來研究急性期神經保護劑的效果以及再灌注引起的神經功能改變，多以栓塞后10 d內[8,29]甚至24 h[30]為研究終點。

血管內介入法由于微創，成為近幾年興起的制備非人靈長類腦卒中模型方法。選擇閉塞MCA是因為這個區域的腦卒中比較常見，而且，動物的上肢運動感覺功能代表區就在該動脈供血區域。實驗中，M 1段栓塞組術后產生大面積腦梗死，范圍與手術切斷M 1的模型一致[11]，也與人類MCA完全閉塞的影像學表現一致。動物因廣泛腦水腫和腦疝于術后38～62 h死亡。下干栓塞組術后初期都有運動感覺缺失，但恢復迅速，7 d后無運動障礙存在，與其他文獻報道一致[14]，這可能因為感覺運動功能代表區不在下干供血區域，早期功能障礙可能與腦水腫有關。上干栓塞組動物均存活，經過量表評定及運動任務測試，4/5的動物患側上肢長期存在運動感覺障礙，1/5急性期后沒有運動缺陷，這可能因為動物個體間的側支循環、顱內血管的分布存在較大變異。這種變異在急性期模型研究中也被發現[31]。

上干栓塞組梗死灶都位于外側裂周圍的額頂葉皮質和部分白質，早期病灶的體積有一定差異，與側支循環建立的豐富程度有關，這也是急性期模型一致性差的主要原因[31]。但慢性期的病灶體積縮小，大小、位置非常相近，且大多數動物慢性期都存在運動功能缺陷，這種運動缺陷的表現和程度一致，即手的動作笨拙、抓握不靈活、不能完成對指動作、感覺遲鈍以及喜歡用健側上肢代替患側上肢完成任務。這顯示慢性期模型從影像和臨床表現兩方面來看一致性都非常高，可用于評價慢性期各種治療措施的效果以及用于神經可塑性研究。

由于購買和維持費用高，而且卒中樣腦損害在急性期死亡風險高，因此非人靈長類卒中慢性期的模型非常珍貴。動物能否安全度過急性期是關鍵。實驗復制了人類重癥監護室密切監測和治療動物，通過精心手術和術后的嚴密監護，使MCA上干栓塞模型制備成功率高，沒有意外事件發生。

實驗證實，MCA上干閉塞制作的卒中模型，動物存活率高，急性期有明顯癱瘓，慢性期長期存在上肢功能障礙，模型重復性和一致性好，適合應用于卒中慢性期各種治療措施效果及病理機制的研究。同時，實驗也發現MCA的M 1段栓塞模型，由于梗死面積較大，急性期腦腫脹明顯，動物死亡率很高；MCA下干栓塞模型在術后7 d自然且完全恢復運動功能。這兩種模型不能應用于慢性期研究。

致謝

衷心感謝北京天壇醫院姜衛劍、杜彬、高峰在動物模型制備方面給予的指導與幫助；感謝北京博愛醫院影像科王明禮，神經康復中心公維軍、孫新亭、胡雪艷在項目中給予的協助。

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Nonhum an Prim ate Chronic Stroke M odel with M idd le Cerebral A rtery Endovascu lar Em bolism

WANG Qiang,ZHANG Tong, ZHAO Chun-yu,etal.Neurological Rehabilitation Centre,CapitalMedical University School ofRehabilitation Medicine,Beijing Bo'aiHospital,China Rehabilitation Research Centre,Beijing 100068,China

Ob jectiveTo establish chronic cerebral infarction animalmodel in nonhuman primate.M ethods10 adultmale rhesusmonkeyswere embolized them iddle cerebral artery(MCA)in contra-lateral of handedness,and divided into M 1 segment embolism group(n= 3),upper trunk embolism group(n=5),and lower trunk embolism group(n=2).Acute neurological deficitwasevaluated with standard neurological scale,and themotor function in chronic stage was assessed with a task of retrieving food pill in wells.Resu ltsAnimals in M 1 segmentembolism group all died 38～62 h after surgery.Upper trunk embolism group survived,and MRIshowed front parietal cortex infarction contra-lateral paralyzed side.A ll of them paralyzed one side in acute stage,and 4 of them persisted dysfunction in chronic stage,that could not finish the task of retrieving food pill in wells;only one completed the task.The lower trunk embolism group paralyzed one side in acute stage,but recovered quickly and completely,that finished the task within 7 d.ConclusionEmbolism of MCA upper trunk can cause infarction of precise and proper size with one side limb dysfunction in the acute stage and long-term dysfunction inmostanimals,which is feasible for treatmentand neural plasticity research in recovery.

cerebral infarction;chronic stage;nonhuman primate;animalmodel;endovascular embolism

R743.3

A

1006-9771(2012)05-0401-05

2011-08-01

2011-11-10)

“十一五”國家科技支撐計劃重大項目(No.2006BAI01A 14)。

1.首都醫科大學康復醫學院，北京市100068；2.中國康復研究中心北京博愛醫院，a.神經康復中心；b.影像科；c.基礎所，北京市100068。作者簡介：王強(1975-)，男，河南淇縣人，博士，主治醫師，主要研究方向：神經疾病康復。通訊作者：張通。

10.3969/j.issn.1006-9771.2012.05.001