超短波對大鼠腦缺血再灌注后腫瘤壞死因子-α和Bcl-2表達的影響①

黃雄昂，葉祥明，林堅，劉曉林，李琳

超短波對大鼠腦缺血再灌注后腫瘤壞死因子-α和Bcl-2表達的影響①

黃雄昂，葉祥明，林堅，劉曉林，李琳

目的觀察超短波對腦缺血再灌注后大鼠海馬、紋狀體和運動皮質內腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及Bcl-2蛋白表達的影響。方法 應用線栓法制備大鼠腦缺血再灌注模型，分為假手術組、造模組、超短波治療組，每組6只。腦組織切片行免疫組織化學染色(SABC法)，觀察TNF-α和Bcl-2在腦組織中表達的變化。結果造模組大鼠海馬、紋狀體和運動皮質TNF-α和Bcl-2的表達明顯高于假手術組(P＜0.01)；超短波治療組TNF-α表達低于造模組，Bcl-2表達高于造模組(P＜0.05)。結論超短波治療通過影響TNF-α和Bcl-2的表達對缺血再灌注腦組織產生一定的保護作用。

腦缺血；缺血再灌注；超短波；腫瘤壞死因子；Bcl-2

[本文著錄格式]黃雄昂，葉祥明，林堅，等.超短波對大鼠腦缺血再灌注后腫瘤壞死因子-α和Bcl-2表達的影響[J].中國康復理論與實踐,2012,18(5):411-413.

許多研究證明，無熱量超短波治療能改善腦缺血再灌注后血流，減輕腦水腫，提高抗氧化酶含量及降低氧自由基產物[1-4]。本研究探討急性腦缺血再灌注后無熱量超短波對腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)及細胞凋亡相關基因Bcl-2蛋白表達的影響，為超短波治療的臨床應用提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 成年健康Sprague-Daw ley(SD)大鼠18只，雌雄不拘，由山東大學動物實驗中心提供，體質量220～270 g；濃縮型鼠抗大鼠TNF-α、Bcl-2單克隆抗體和SABC免疫組化檢測試劑盒均購自武漢博士德公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組 將實驗動物分為假手術組、造模組、治療組3組，每組6只。假手術組和造模組術后不做任何處理，治療組在造模后6 h給予超短波治療。所有大鼠于術后24 h處死取材。

1.2.2 動物模型制備 應用線栓法建立大腦中動脈閉塞(m iddle cerebral artery occlusion,MCAO)再灌注模型[5]。動物蘇醒后出現左側霍納征，提尾右前肢屈曲，或爬行向右側劃圈者為手術成功標志。假手術組除不插尼龍線外，其余步驟相同。3組于術后返回鼠籠喂養。

1.2.3 超短波治療 采用上海電子儀器廠生產的五官超短波治療機，頻率40.68 MHz，最大輸出功率40W，調諧后第1檔輸出功率約11W。大鼠固定于特制的塑料固定器內，直徑4 cm圓形電極對置于大鼠腦兩側，電極與大鼠頭部皮膚間隔2 cm，治療時間10m in。

1.2.4 組織切片制備與免疫組織化學染色 取前囟前2～4mm(運動皮質區和紋狀體區)、前囟后3～5mm(海馬區)各厚2mm兩塊冠狀組織塊置于4%多聚甲醛中固定24 h，常規脫水，石蠟包埋，冠狀連續切片，片厚4μm。每塊大鼠腦組織均分別制作1張TNF-α和Bcl-2免疫組化染色切片。免疫組化測定采用SABC法，按照試劑盒說明書進行操作。陰性對照用0.1 mol/L PBS代替一抗。

1.2.5 免疫組化圖像采集與分析 采用Leica IM 50圖像采集系統對各組免疫組化切片進行圖像采集，在各大鼠腦組織切片的海馬(CA1～3)區、紋狀體區和運動皮質區隨機選取6個完整而不重疊的高倍鏡視野(400×)采圖，其中海馬CA 1、CA2、CA 3區的錐體層各取2個視野，應用Image-Pro Plus圖像分析軟件對每個視野下陽性反應物的平均光密度和陽性面積率進行測定。以每例6個視野的平均光密度和陽性面積率的平均值做為該例相應區域的測量值。

1.3 統計學分析 所有數據采用SPSS 12.0軟件進行處理，實驗數據以(±s)表示，兩樣本均數間比較采用t檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 大體觀察 造模組及治療組大體檢查均見患側大腦半球腦水腫明顯，顏色蒼白，腦溝腦回模糊不清，組織較脆，呈豆腐渣樣。

2.2 免疫組化染色 TNF-α和Bcl-2免疫組化染色陽性物質呈棕黃色顆粒，聚集于神經元胞體及軸突，神經膠質細胞和神經纖維網也可見較多陽性顆粒物沉著。假手術組免疫陽性顆粒染色淺，數量少；造模組和治療組海馬、紋狀體及運動皮質神經細胞胞漿可見大量深棕色TNF-α和黃色Bcl-2免疫陽性顆粒，其中運動皮質各層神經細胞均有陽性反應，特別是大錐體細胞和大梭形細胞胞漿呈現大量典型的陽性顆粒物。

2.3 圖像分析 與假手術組比較，造模組不同腦區TNF-α和Bcl-2平均光密度與陽性面積率都明顯增高(P＜0.01)；治療組TNF-α各腦區平均光密度和陽性面積率均低于造模組(P＜0.05)，Bcl-2平均光密度均顯著高于造模組(P＜0.001)，海馬及運動皮質區陽性面積率高于造模組(P＜0.05)。見表1、表2。

3 討論

目前認為，腦缺血再灌注損傷是多種致病機制共同作用、互相促進的結果，其中腦組織長時間缺血缺氧造成能量代謝紊亂、神經元電活動衰竭、細胞膜去極化、細胞膜離子梯度喪失，進而引起細胞死亡；即使在短時間內完全恢復血供，繼發性損傷(如神經元凋亡、自由基生成增多、鈣超載、興奮性氨基酸堆積、炎性細胞浸潤等)仍將影響腦組織功能。

表1 各組不同腦區TNF-α和Bcl-2平均光密度

表2 各組不同腦區TNF-α和Bcl-2陽性面積率(%)

TNF-α是機體炎癥和免疫應答的重要介質，Vila、W ittmann等發現，TNF-α水平在腦缺血時增高，且與腦缺血程度、神經功能缺損程度、急性腦梗死面積和部位等密切相關[6-7]。Bcl-2是重要的抗凋亡基因，能抑制多種損傷因子激發的細胞凋亡。有研究表明，Bcl-2可調節線粒體通透性，抑制細胞色素C釋放和脂質過氧化物的形成，阻止氧化應激反應，加強線粒體攝取鈣離子的作用，提高線粒體對鈣離子誘導的呼吸鏈損傷的耐受力，從而抑制細胞凋亡過程[8-9]。

腦梗死的臨床治療強調超早期改善局部腦組織血液供應。超短波能加速血流，擴張血管，改善組織器官血液循環，增加血管壁通透性。

結合以往對缺血再灌注腦血流量時間窗的研究[10]和超短波的作用特性，在再灌注初期(6 h以內)腦血流量突然增加，形成所謂高灌注狀態，此時如給予超短波治療則會進一步增加血流，不僅可能造成出血，而且可促進神經細胞凋亡，加重損傷；而在再灌注6 h以后，血流量降低，形成低灌注狀態，這時給予超短波治療則可緩解低灌注狀態，減輕其缺氧缺血，抑制細胞凋亡，對再灌注損傷起保護作用。本實驗選擇在造模后6 h進行超短波治療，符合以往研究提示的治療時機。

目前大多數人認為，超短波對腦缺血再灌注損傷的治療作用主要與改善局部腦供血狀態有關。此外也有文獻報道，無熱量超短波的非熱效應產生的高頻振蕩，可以使組織中的離子、偶極子、微粒之間的摩擦增加，促使組織各種成分的交換，改變了組織的理化過程，在此作用下出現生長發育迅速、神經纖維再生加速、白血球吞噬作用加強等效果[11]。本研究顯示，超短波能減少缺血再灌注大鼠腦中TNF-α的表達，增加Bcl-2的表達，從而減少繼發性炎性反應對腦組織的損害，減少神經細胞凋亡發生，有助于腦功能恢復。這一作用機制是否與非熱效應有關，還有待進一步研究。超短波療法對缺血再灌注損傷腦組織有一定的保護作用，在改善腦血流、治療缺血性腦血管病方面有較好的應用前景。但其作用機制、治療劑量、最佳治療時機，以及治療中的安全保障等諸多方面仍有待進一步研究。

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Effect of U ltrashortW ave Diatherm y on Exp ression of Tum or Necrosis Factor-αand Bcl-2 after Cerebral Ischem ia/Reper fusion in Rats

HUANG Xiong-ang,YE Xiang-m ing,LIN Jian,et al.Department ofRehabilitation Medicine,Zhejiang Provincial People's Hospital, Hangzhou 310014,Zhejiang,China

Ob jectiveTo observe the effects of ultrashortwave diathermy on the expression of tumor necrosis factor-α(TNF-α)and Bcl-2 in hippocampus,striatum and motor cortex of ratswith cerebral ischem ia/reperfusion.M ethodsThemodel of focal ischem ia/reperfusion in Sprague-Daw ley ratswas induced with intralum inalm iddle cerebral artery occlusion(MCAO)with nylonmonofilament suture.The ratswere divided into 3 groups:sham group(n=6),model group(n=6)and ultrashortwave diathermy group(n=6).Brain tissue sliceswere immunohistochem ically stained(SABC)to observe the expression of TNF-αand Bcl-2.Resu ltsThe expression of TNF-αand Bcl-2 in left hippocam pus,striatum andmotor cortex was higher in themodelgroup than in the sham group(P＜0.01).The expression of TNF-αwas lower but Bcl-2 was higher in the ultrashortwave diathermy group than in themodel group(P＜0.05).ConclusionU ltrashortwave diathermy can affect the expression of TNF-αand Bcl-2,whichmay associate to the neuroprotection from focal cerebral ischem ia/reperfusion injury.

cerebral ischem ia;ischem ia/reperfusion;ultrashortwave diatherm y;tumor necrosis factor;Bcl-2

R743.3

A

1006-9771(2012)05-0411-03

2012-01-16

2012-04-06)

浙江省人民醫院康復醫學科，浙江杭州市310014。作者簡介：黃雄昂(1978-)，男，浙江遂昌縣人，碩士，醫師，主要研究方向：神經系統疾病康復。

10.3969/j.issn.1006-9771.2012.05.004