神經干細胞-施萬細胞-聚乳酸-羥基乙酸共聚物支架移植對脊髓損傷大鼠的影響①

夏雷，郝淑煜，李德志，陳剛，高川川，歷俊華，萬虹

·基礎研究·

神經干細胞-施萬細胞-聚乳酸-羥基乙酸共聚物支架移植對脊髓損傷大鼠的影響①

夏雷1，郝淑煜2，李德志2，陳剛3，高川川1，歷俊華4，萬虹4

目的探討種植神經干細胞(NSCs)與施萬細胞(SCs)的聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)支架移植促進脊髓損傷大鼠神經功能恢復的作用及機制。方法體外培養NSCs和SCs，以PLGA為支架移植入大鼠T8半橫斷脊髓損傷處。實驗動物隨機分為PLGA組、PLGA+NSCs組和PLGA+NSCs+SCs組。術前和術后進行皮層運動誘發電位(CMEPs)檢查及BBB評分；然后在同側或對側進行T6再次半橫斷，并進行CMEPs檢測及BBB評分。結果CMEPs的恢復率及波幅在PLGA+NSCs+SCs組最高。移植后，大鼠BBB評分逐漸改善；在移植后第2周及以后，PLGA+NSCs組和PLGA+NSCs+SCs組的BBB評分顯著高于PLGA組(P＜0.001)。同側再次半橫斷后，CMEPs消失，BBB評分快速恢復；對側再次半橫斷后，大鼠雙下肢完全癱瘓。結論種植NSCs和SCs的PLGA支架移植有利于脊髓損傷功能重建，再生軸突可能形成了功能性連接；但是同側再生軸突對脊髓功能的恢復作用有限。

脊髓損傷；組織工程；神經干細胞；施萬細胞；聚乳酸-羥基乙酸共聚物；支架

[本文著錄格式]夏雷，郝淑煜，李德志，等.神經干細胞-施萬細胞-聚乳酸-羥基乙酸共聚物支架移植對脊髓損傷大鼠的影響[J].中國康復理論與實踐,2012,18(5):417-419.

組織工程技術結合生物材料、細胞或組織、生物活性分子、組織微環境的刺激機械力[1]，一些包含細胞外基質、細胞、多聚物或支架的[2-4]工程化物質已經顯示出支持再生和功能恢復的潛力。神經干細胞(neural stem cells,NSCs)和施萬細胞(Schwann cells,SCs)被認為是促生長細胞，長期以來一直被用于脊髓損傷的研究[5-8]。我們設計了一種新型PLGA取向支架，具有多個縱向平行排列的微管(直徑200～300μm)，微管壁上有直徑10～20μm的孔隙，使微管之間能互相溝通，以利于分子交換，在其中種入NSCs和SCs，使移植細胞在取向支架內有序排列[9-11]。本研究將細胞-支架組織工程復合物移植到大鼠脊髓半橫斷損傷處，分析大鼠神經功能恢復情況及其機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器 孕14～16 d和新生1～3 d W istar大鼠，購自中國醫學科學院動物研究所。健康雌性W istar大鼠，體重250～300 g，共105只，術后最終存活并完成實驗63只。實驗大鼠隨機分為3組：①PLGA組(n=30)：脊髓半橫斷后移植含DMEM培養液的PLGA支架；②PLGA+NSCs組(n=30)：脊髓半橫斷后移植種植了NSCs的PLGA支架；③PLGA+NSCs+ SCs組(n=45)：脊髓半橫斷后移植種植了NSCs、SCs的PLGA支架。神經術中電生理監測儀：美國AXON公司。

[11-13]構建GFP-HIV載體轉染NSCs。

PLGA取向支架由中國科學院化學研究所王身國教授提供，經環氧乙烷氣體滅菌后儲存備用。

參考文獻[12]體外培養NSCs和SCs并鑒定。

參考文獻[2,9,14]制作大鼠脊髓T8半橫斷損傷模型。

1.2 PLGA-NSCs-SCs復合體的構建 PLGA取向支架4×1.5×1.2mm，浸入DMEM/F12液中。用微量移液器吸取5μl細胞懸液，含5×105NSCs和5×105SCs (PLGA+NSCs+SCs組)或1×106NSCs(PLGA+NSCs組)垂直滴于PLGA支架頂端，將支架置于濾紙上，使細胞懸液完全吸入支架[15]。將支架置于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養液中2 h，植入橫斷處。

1.3 電生理檢查 術前和術后第1、24周時進行皮層運動誘發電位(corticalmotor evoked potentials,CMEPs)檢查。第25周取PLGA+NSCs+SCs組3只大鼠進行同側T6半橫斷，再次行CMEPs檢測。

于前囟后方2mm，矢狀縫外側2mm(感覺運動皮層)鉆一直徑1.2 mm的骨孔，直達硬膜。以直徑1.2 mm不銹鋼螺旋電極鉆入骨孔，深度1mm，為刺激電極；參考電極為針狀電極，插入鼻尖后方5mm頭皮中線上；另一針狀電極插入尾根部，作為地線；感應電極為一對針狀電極，插入脛前肌。刺激強度10 V，至少重復2次。

1.4 運動功能 采用Basso-Beattle-Bresnahan(BBB)評分進行后肢運動功能評分。移植前1周，實驗大鼠進行兩次BBB評分，使其適應測試和測試環境。于移植后1、2、3、4、8、12和24周在固定、較開放的環境中對實驗大鼠活動錄像，由2位不了解治療分組的觀察者獨立對大鼠后肢運動功能進行評分，每個時間點觀察3次，每次4 m in。第25周取PLGA+NSCs+SCs組3只大鼠進行同側T6半橫斷，3只對側T6半橫斷，再次行BBB評分，每周1次，共2周。

2 結果

2.1 CMEPs 術后1周，各組大鼠的CMEPs均消失。術后24周，大鼠CMEPs有不同程度的恢復。CMEPs恢復率和CMEPs波幅在PLGA+NSCs+SCs組最高(P＜0.05)。CMEPs潛伏期在各組之間無顯著性差異。見表1。同側再次半橫斷后，CMEPs消失。

表1 CM EPs恢復情況

2.2 BBB評分 移植后24周內，大鼠后肢運動功能逐漸改善。第2周及以后，PLGA+NSCs組和PLGA+ NSCs+SCs組的評分顯著高于PLGA組(P＜0.001)。但PLGA+NSCs組和PLGA+NSCs+SCs組的BBB評分在各時間點都沒有顯著性差異。見表2。

表2 各組BBB評分的比較

同側再次半橫斷后，大鼠麻醉蘇醒后(大約術后2 h)BBB評分達到(1.33±0.33)，2周后達到(11.67± 0.33)。對側再次半橫斷后，大鼠出現雙下肢完全癱瘓(BBB評分為0)，并持續1周，第2周達到(0.67± 0.33)。見表3。

表3 不同側別再次半橫斷后BBB評分比較

3 討論

三維取向支架為支持移植細胞的存活和軸突再生提供了一個平臺。我們以前的實驗顯示，在體內外，PLGA支架與NSCs和SCs有良好的親和性和相容性[16-17]；PLGA支架移植后，脊髓組織缺損減少，支架中血管形成[18]。

移植術后第24周，一些大鼠的CMEPs有不同程度恢復；同側再次半橫斷后，恢復的CMEPs消失。提示CMEPs由同側再生軸突傳導，并形成了功能性連接。我們以前的實驗顯示，聯合NSCs和SCs有利于軸突再生和髓鞘化[2]。這一結果與本實驗的電生理評價一致。

CMEPs的恢復率及平均波幅在PLGA+NSCs+SCs組最高，提示有更多的軸突再生，并形成功能性連接。NSCs和SCs被認為是促生長細胞，長期以來一直被用于脊髓損傷的研究[5-8,19]。SCs能分泌多種神經營養因子、細胞黏附分子和細胞外基質，還有形成髓鞘的能力[20]。而NSCs促生長能力一般歸因于神經營養因子的連續分泌[21]。有人認為，一些來源于NSCs的星形膠質細胞(一般認為它們阻礙軸突再生)有利于再生。NSCs來源的星形細胞表型還不成熟，這些細胞可能對神經椎的生長起支持作用[22]。還有研究發現，波形蛋白陽性的星形細胞與再生軸突關系密切，這些細胞可能通過接觸介導機制對軸突起引導作用[23]。

為了明確再生對功能恢復的作用，我們進行了同側或對側再損傷實驗。同側再次半橫斷并未完全破壞同側下肢的運動功能，但是對側再次半橫斷導致雙側下肢的完全癱瘓。提示再生軸突對同側功能的恢復作用有限。這可能也是為什么電生理評價PLGA+NSCs+ SCs組恢復良好，但BBB評分卻不夠理想的原因。

再生軸突對功能恢復的作用有限可能是由于再生軸突的數量較少。我們以前的實驗結果顯示，大部分NSCs遷移到鄰近脊髓區域并死亡[9-10]。因此，支架中NSCs數量不足，不能產生顯著的NSCs誘導的細胞接觸介導的軸突再生(NSCs-induced cell-contact-mediated axonal regeneration)，而后者對軸突再生起作用[22]。

[參考文獻]

[1]Norman LL,Stroka K,A randa-Espinoza H.Guiding axons in the central nervous system:a tissue engineering approach[J]. Tissue Eng PartB Rev,2009,15(3):291-305.

[2]Chen G,Hu YR,Wan H,et al.Functional recovery follow ing traumatic spinal cord injury mediated by a unique polymer scaffold seeded with neural stem cells and Schwann cells[J]. Chin M ed J(Engl),2010,123(17):2424-2431.

[3]Lampe KJ,Kern DS,M ahoney M J,etal.The adm inistration of BDNF and GDNF to the brain via PLGA m icroparticles patterned within a degradable PEG-based hydrogel:protein distribution and the glial response[J].JBiomed Mater Res A,2011, 96(3):595-607.

[4]Zuidema JM,Pap MM,Jaroch DB,et al.Fabrication and characterization of tunable polysaccharide hydrogel blends for neural repair[J].Acta Biomater,2011,7(4):1634-1643.

[5]Schaal SM,Kitay BM,Cho KS,etal.Schwann cell transplantation improves reticulospinal axon grow th and forelimb strength after severe cervical spinal cord contusion[J].Cell Transplant, 2007,16(3):207-228.

[6]Tarasenko YI,Gao J,Nie L,et al.Human fetal neural stem cells grafted into contusion-injured ratspinal cords improve behavior[J].JNeurosciRes,2007,85(1):47-57.

[7]Niapour A,Karamali F,Nemati S,et al.Co-transplantation of human embryonic stem cell-derived neural progenitors and Schwann cells in a rat spinal cord contusion injury model elicits a distinct neurogenesis and functional recovery[J].Cell Transplant,2011,Epub ahead of print

[8]Wang JM,Zeng YS,Wu JL,et al.Cograft of neural stem cells and Schwann cells overexpressing TRKC and neurotrophin-3 respectively after rat spinal cord transection[J].Biomaterials, 2011,32(30):7454-7468.

[9]夏雷,萬虹,歷俊華,等.神經干細胞與許旺細胞共移植于大鼠損傷脊髓[J].中華神經外科雜志,2008,24(10):740-743.

[10]高川川,夏雷,郝淑煜,等.綠色熒光蛋白標記的大鼠神經干細胞移植于損傷脊髓后的遷移和存活[J].中國康復理論與實踐,2008,14(4):341-342.

[11]Yang F,Qu X,CuiW,et al.M anufacturing and morphology structure of polylactide-type m icrotubules orientation-structured scaffolds[J].Biomaterials,2006,27(28):4923-4933.

[12]Wan H,An Y,Zhang Z,etal.Differentiation of ratembryonic neural stem cells promoted by co-cultured Schwann cells[J]. Chin Med J(Engl),2003,116(3):428-431.

[13]萬虹,劉松,陳剛,等.HIV-1來源的慢病毒載體轉染大鼠脊髓神經干細胞[J].中華神經外科雜志,2006,(12):753-755.

[14]郝淑煜,夏雷,李德志,等.轉染綠色熒光蛋白的神經干細胞移植于半橫斷脊髓損傷處的體內外分化研究[J].中華神經外科雜志,2010,(7):649-651.

[15]Hurtado A,Moon LD,Maquet V,et al.Poly(d,l-lactic acid) macroporous guidance scaffolds seeded with Schwann cells genetically modified to secrete a bi-functional neurotrophin implanted in the completely transected adult rat thoracic spinal cord[J].Biomaterials,2006,27(3):430-442.

[16]李德志,萬虹,揚飛,等.施萬細胞和神經干細胞在PLGA支架中共培養的掃描電鏡觀察[J].中華神經外科雜志,2006,(3): 174-176.

[17]陳剛,萬虹,揚飛,等.乙交酯-丙交酯共聚物與大鼠脊髓組織的生物相容性[J].中國組織工程研究與臨床康復,2007,11 (1):176-177.

[18]陳剛,李德志,萬虹,等.組織工程材料PLGA與組織細胞生物相容性的體內實驗研究[J].中華神經外科雜志,2007,23(1): 60-62.

[19]夏雷,萬虹,王忠誠.Schwann細胞移植在脊髓損傷治療中的應用進展[J].中國康復理論與實踐,2006,12(7):553-555.

[20]Taylor JS,Bampton ET.Factors secreted by Schwann cells stimulate the regeneration of neonatal retinal ganglion cells[J]. JAnat,2004,204(1):25-31.

[21]Lu P,Jones LL,Snyder EY,et al.Neural stem cells constitutively secrete neurotrophic factors and promote extensive host axonal grow th after spinal cord injury[J].Exp Neurol,2003, 181(2):115-129.

[22]Pfeifer K,Vroemen M,Blesch A,et al.Adult neural progenitor cells provide a perm issive guiding substrate for corticospinal axon grow th follow ing spinal cord injury[J].Eur JNeurosci,2004,20(7):1695-1704.

[23]Hsu JY,Xu XM.Early profiles of axonal grow th and astroglial response after spinal cord hem isection and implantation of Schwann cell-seeded guidance channels in adult rats[J].JNeurosciRes,2005,82(4):472-483.

Effect of Com p lex of Neural Stem Cells,Schwann Cells,and Poly(Lactic-co-glycolic Acid)Scaffolds Transp lant on Spinal Cord Injured Rats

XIA Lei,HAO Shu-yu,LIDe-zhi,etal.Beijing Sanbo Brain Hospital,CapitalMedical University,Beijing 100093,China

Ob jectiveTo explore the effect of transplanting poly(lactic-co-glycolic acid)(PLGA)scaffolds seeded with neural stem cells(NSCs)and Schwann cells(SCs)on spinal cord injured rats and themechanism.M ethodsNSCs and SCs were cultured in vitro and then seeded into the directional PLGA scaffolds.Then PLGA-cell complexes were implanted into the spinal cord hem isected rats,which were divided into PLGA group,PLGA+NSCs group and PLGA+NSC+SCs group.The ratswere tested with corticalmotor evoked potentials(CMEPs)and Basso-Beattle-Bresnahan(BBB)score.Then,the ratswere further ipsilaterally or contralateral hem isected at T6and tested with CMEPs and BBB score again.Resu ltsThe incidence of recovery and the amplitudes of CMEPswere the highest in PLGA+NSCs+ SCs group.The rats exhibited a gradual improvement in hindlimb locomotor function in score.The BBB score was the least in the PLGA group in the 2nd week or later.A fter retransected ipsilaterally,the CMEPs disappeared again and the BBB score improved quickly.Butafter retransected contralaterally,the ratswere completely paraplegia.ConclusionThe directional PLGA scaffolds seeded with NSCs and SCs facilitate the recovery in spinal cord injured rats,whichmay associatewith axonal regeneration and functional connections,but play a lim ited role.

spinal cord injury;tissue engineering;neuralstem cells;Schwann cells;poly(lactic-co-glycolic acid);scaffold

R651.2

A

1006-9771(2012)05-0417-03

2012-02-20

2012-03-28)

國家自然科學基金國際合作研究資助項目(30540450581)。

1.北京三博腦科醫院，首都醫科大學第十一臨床學院，北京市100093；2.首都醫科大學附屬北京天壇醫院，北京市100050；3.無錫市第四人民醫院神經外科，江蘇無錫市214062；4.首都醫科大學附屬北京市神經外科研究所，北京市100050。作者簡介：夏雷(1978-)，男，湖南益陽市人，博士，主治醫師，主要研究方向：中樞神經系統損傷修復。通訊作者：萬虹。

10.3969/j.issn.1006-9771.2012.05.006