益生菌Lactobacillus casei Zhang在酸脅迫下的蛋白質組學研究*

烏日娜，岳喜慶，張和平

1(沈陽農業大學食品學院，遼寧沈陽，110866)

2(內蒙古農業大學教育部乳品與生物技術重點實驗室，內蒙古呼和浩特，010018)

益生菌Lactobacillus casei Zhang在酸脅迫下的蛋白質組學研究*

烏日娜1，岳喜慶1，張和平2

1(沈陽農業大學食品學院，遼寧沈陽，110866)

2(內蒙古農業大學教育部乳品與生物技術重點實驗室，內蒙古呼和浩特，010018)

Lactobacillus casei Zhang是1株篩選自發酵酸馬奶，并具有耐酸等益生特性的益生乳桿菌。該研究利用蛋白質組雙向電泳，比較了其在pH值為7.0和5.5的培養液中分別生長至對數生長期中期的蛋白質組表達差異。結果表明，有11個蛋白質點表達發生明顯變化，經過基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜鑒定，其中有3個表達增強的蛋白質點分別鑒定為翻譯因子(EF-Tu)，N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸脫醛酶(NagA)和小熱休克蛋白(sHsp)。酸脅迫可誘導乳酸菌產生復雜的酸應激反應，涉及不同的代謝調控途徑。

Lactobacillus casei Zhang，蛋白質組，酸脅迫

酸馬奶是由乳酸菌和酵母菌發酵而成的酒精性飲料，在中國的內蒙古、蒙古和俄羅斯等地十分流行。研究顯示，干酪乳桿菌屬是采集于內蒙古地區的酸馬奶樣品中的優勢乳桿菌發酵劑[1］。張和平教授等從中篩選出1株益生菌Lactobacillus casei Zhang。該菌株具有較強的耐酸和耐膽鹽特性，且可對小鼠的細胞免疫功能產生多方面的、有利于機體免疫功能的調節作用[2-3］。

耐酸特性是篩選益生菌的一個基本條件，因為當益生菌以制劑或與食品口服，需要經過胃部的酸性環境脅迫，并且達到一定的活菌數，才有可能進入腸道進而定植。為了探索益生菌對酸脅迫產生的應激反應機理，蛋白質組學技術是十分有效的方法之一。蛋白質組(proteome)是指由1個基因組所表達的全套蛋白質[4］。雙向凝膠電泳(Two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)是蛋白質組學研究的核心技術，由O＇Farrell等提出[5］。利用雙向電泳技術構建蛋白質表達圖譜，可以分離得到數以百計的蛋白質。然而，有關乳酸菌蛋白質組學的研究開展較晚。目前國外已報道了Lactococcus lactic[6］和雙歧桿菌Bifidobacterium longum[7］，及部分乳桿菌 Lactobacillus sanfranciscensis[8］，Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus[9］，Lactobacillus reuteri[10］等在酸脅迫下的蛋白質組學研究。結果表明，酸脅迫條件可誘導乳酸菌蛋白質表達發生變化。但是，上述研究多以酸適應性反應(acid tolerance response，ATR)為酸脅迫的條件，而對乳酸菌在酸環境下生長的蛋白質組學研究較少。

本項研究以益生菌L.casei Zhang為研究對象，利用雙向電泳技術構建了該菌株在pH值分別為7.0和5.5的培養條件下對數生長中期的蛋白質組表達譜，并且進行了差異比較分析，為揭示其中可能與L.casei Zhang耐酸特性的分子機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種:干酪乳桿菌L.casei Zhang，由內蒙古農業大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室提供。

改良MRS培養基:蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，酵母膏粉 10 g，葡萄糖 20 g，吐溫-801g，K2HPO42 g，乙酸鈉5g，檸檬酸三銨2g，MgSO4·7H2O 0.2 g，Mn-SO4·4H2O 0.05 g。

試劑:MES、MOPS，北京天為時代公司;丙烯酸胺、Tris、SDS、TEMED、N，N＇-甲叉雙丙烯酞胺、硝酸銀、三氯乙酸，美國 Sigma公司;尿素、硫脲、DTT、CHAPS、碘乙酰胺、考馬斯亮藍、IPG(Immobilized pH gradient)干膠條(18 cm、pI 4～7)，美國Bio-rad公司;正丁醇、過硫酸胺、無水乙酸鈉、丙酮、EDTA、Na2S2O3、Na2CO3等。

1.2 儀器與設備

等電聚焦儀、Ettan DALT Twelve system裝置、Image Scanner掃描儀及Image Master 5.0圖像分析系統，美國GE公司;TGL-168低溫離心機，德國Eppen-dorf公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 干酪乳桿菌的培養

將活化3代的L.casei Zhang供試菌液以1%的量(OD600nm約為0.06)分別接種于新鮮的MRS培養基中，培養基中含有100 mmol/L的MES和MOPS緩沖劑，pH值分別為 pH7.0和 pH5.5(用 KOH調節)[11］。以每管5 mL的量分裝試管，37℃恒溫培養箱中培養24 h。每隔1 h取樣，繪制L.casei Zhang在不同pH值條件培養下的生長曲線。

1.3.2 蛋白質樣品的提取與制備

離心收集對數生長中期的菌體，利用研缽將收集的菌體進行液氮研磨破碎，然后采用TCA/丙酮沉淀法制備蛋白質樣品[5，12］。利用 Bradford法測定蛋白質濃度。

1.3.3 雙向凝膠電泳[13］

將菌體蛋白樣品100 μg加入溶脹液中，使總體積為350 μL。充分混勻后，將其加入到持膠槽中，并將IPG干膠條，膠面向下放于樣品之上進行溶脹。膠條溶漲后，進行第一向等電聚焦。等電聚焦參數為:無電壓6 h，50 V 恒電壓電泳6h;250、500、4000 V和8000 V線性梯度電壓電泳1 h，再以8000 V電壓電泳65000 V·h。聚焦結束后，將膠條分別放入含有1%濃度DTT的SDS平衡液和含有2.5%濃度的碘乙酞胺SDS平衡緩沖液中，于搖床上平衡15 min。然后，將膠條轉移至12%的SDS聚丙烯酞胺凝膠(26 cm×20 cm)，進行電泳，約5～6 h后，停止電泳，取下凝膠采用銀染法進行染色。

1.3.4 圖像分析及質譜鑒定

利用Image 5.0圖像分析軟件對凝膠圖像進行分析。選取同一條件下的2塊平行膠構建一個參考膠，然后通過參考膠蛋白質量(volume)的匹配和比較進行不同條件下蛋白質表達的分析，對能匹配上的點進行位置和量重復性分析，對不能匹配上的點進行差異表達量分析。

從膠上選取差異蛋白點，切下后，經胰酶消化，并利用MALDI-TOF/MS質譜對肽段樣品進行鑒定。質譜參數設置為默認值，加速電壓19 kV，m/z范圍為600～4000，誤差范圍為10 ppm。通過軟件MASCOT software 1.9(Matrix Science)，以NCBInr數據庫中革蘭氏陽性菌已知數據為基礎，進行蛋白質序列數據庫檢索鑒定。

2 結果與分析

2.1 不同pH值條件下生長曲線的繪制

L.casei Zhang在pH7.0和pH5.5的MRS培養基中生長，其生長曲線如圖1所示。在低pH條件下，細菌總數明顯降低，說明該菌株的生長受到抑制。此外，緩沖劑的加入，使L.casei Zhang在進入穩定期前可維持初始pH在±0.1～±0.3的范圍內緩慢降低，可基本維持pH7.0和pH5.5，在進入穩定期后，培養液的pH值才會顯著下降。

圖1 干酪乳桿菌在不同pH值條件下的生長曲線

2.2 雙向電泳圖像分析

圖2 L.casei Zhang在不同pH下生長至對數生長期中期的蛋白質組雙向電泳表達圖譜

利用雙向電泳技術，試驗中構建了 L.casei Zhang在不同pH值下生長的蛋白質組2-DE圖譜(圖1)。通過Image 5.0圖像分析，結果表明，2塊平行膠的匹配率均在90%以上，可檢測到的斑點分別為493 ±6(pH 7.0)和496±8(pH 5.5)。

2.3 雙向電泳差異表達譜比較

經Image 5.0圖像分析軟件比較分析顯示，L.casei Zhang在pH7.0和pH5.5生長至對數生長中期的2-DE表達譜中，有11個蛋白質點表達發生明顯變化(2.5倍以上)，如表1所示。

表1 L.casei Zhang在pH7.0和pH5.5培養基MRS中生長至對數生長期中期的差異表達蛋白質

由表1可知，在11個差異表達蛋白質點中，3個差異表達蛋白質點可通過質譜技術鑒定為對應的蛋白，有8個差異表達蛋白質點未鑒定出匹配結果。其中，有6種蛋白質在穩定期表達強度增強2.5倍以上，包括翻譯因子(EF-Tu，spot Z1)，N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸脫醛酶(NagA，spot Z4)，小熱休克蛋白(sHsp，spot Z10)，及未鑒定出的蛋白質點(spot Z2，spot Z5和 spot Z8);而有3個蛋白質(spot Z6，spot Z7，spot Z9)的表達量在穩定期下降;有2個蛋白質點分別只在pH 7.0(Unidentified，spot Z11)或者pH 5.5對生長期表達(Unidentified，spot Z3)。

3 討論

酸脅迫可誘導乳酸菌產生復雜的酸應激反應，涉及不同的代謝調控途徑。L.casei Zhang在pH5.5的MRS生長，與在pH7.0的MRS生長的2-DE圖譜差異比較分析，由酸誘導表達上調的3種蛋白質，就屬于應激蛋白、糖代謝和翻譯代謝調控3種不同的路徑。此外，在L.casei Zhang對數生長期與穩定期生長的2-DE比較研究中，這3種蛋白質的表達量在穩定期時也強于對數期。

3.1 應激蛋白質

L.casei Zhang中小熱休克蛋白(sHsp，spot Z10)在pH 5.5時表達增強。熱休克蛋白質是被較早發現的一類應激蛋白質，具有修復或解折疊損傷蛋白質的生物學功能[14］。熱休克蛋白 GroEL(Hsp 60)和DnaK(Hsp 70)是較為常見的應激反應蛋白質，多個蛋白質組研究都報道了不同乳酸菌在酸應激反應下被誘導，并且，不同的環境脅迫也可誘導GroEL和DnaK產生表達量的變化[15］。目前，有關乳酸菌小熱休克蛋白的研究相對較少。

3.2 糖代謝及細胞膜保護作用

NagA可催化氨基糖類的代謝，及催化N-乙酰-D-6-磷酸葡萄糖胺與D-6-磷酸果糖的轉化，而N-乙酰-D-6-磷酸葡萄糖胺是N-乙酰-D-葡萄糖胺和UDP-N-乙酰胞壁酸的前體，所以，NagA與細菌細胞壁肽聚糖和磷壁酸的合成有關[16］。細胞壁是細菌抵抗外界環境的第一道屏障。NagA的表達量在低酸是表達量增強，有利于維持細胞形態，增強細胞壁的保護作用。

3.4 翻譯因子

L.casei Zhang的延伸因子EF-Tu在pH5.5時有明顯增強，它的主要功能不僅是傳送aminoacyl-tRNA到核糖體，同時對Escherichia coli的研究表明，EF-Tu與蛋白質的折疊或應激保護有關[17-18］。L.reuteri和P.freudenreichii[10，19］的蛋白質組研究報道，酸脅迫可誘導相應的EF-Tu蛋白發生表達量發生變化。因此可能說明，L.casei Zhang的EF-Tu的變化與其酸應激反應有關。

未鑒定出結果的差異表達蛋白質斑點可能在L.casei Zhang的耐酸生長過程中起到重要作用，因此，下一步筆者將繼續完成蛋白質點的鑒定及驗證工作。

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ABSTRACTLactobacillus casei Zhang，isolated from traditional home-made koumiss in Inner Mongolia of China，has been considered as a new probiotic bacterium for its characteristics，especially acid tolerance.Proteomics researches were carried out to identify proteins expression of Lactobacillus casei Zhang grown at different pH values of pH 7.0 and 5.5.Cytosolic proteins of mid-exponential phase were resolved and further analyzed by two-dimensional gel electrophoresis.As results shown，eleven protein spots were found showing statistically significant differences.Three of total protein spots were identified as EF-Tu，NagA and sHsp using matrix-assisted laser desorption/ionization timeof-flight mass spectrometry(MALDI-TOF/MS)，indicating the complex response of lactic acid bacteria to acid stress.

Key wordsLactobacillus casei Zhang，proteomics，acid stress

Proteomics Researches on Acid Response of Lactobacillus casei Zhang Grown at Different pH Values Using Two-Dimensional Gel Electrophoresis

Wu Ri-na1，Yue Xi-qing1，Zhang He-ping2
1(College of Food Science，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866，China)
2(Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Bioengineering，Ministry of Education，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010018，China)

博士研究生(張和平教授為通訊作者)。

*國家自然科學基金項目(31025019;31000805);教育部創新團隊發展計劃(IRT0967);973計劃前期研究專項基金項目(2010CB134502);教育部創新團隊發展計劃(IRT0967);“863”計劃項目(2011AA100902);遼寧省高等學校優秀人才支持計劃(LJQ2011071);沈陽農業大學“天柱山英才計劃”

2012-02-03，改回日期:2012-06-11