天山凍土中產低溫蛋白酶菌株的篩選、鑒定及酶學性質*

祁丹丹，楊瑞金，華霄，沈蓮蓮，張文斌，趙偉

1(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫，214122)

2(江南大學食品學院，江蘇 無 錫，214122)

天山凍土中產低溫蛋白酶菌株的篩選、鑒定及酶學性質*

祁丹丹1，楊瑞金2，華霄2，沈蓮蓮1，張文斌2，趙偉2

1(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫，214122)

2(江南大學食品學院，江蘇 無 錫，214122)

借助形態觀察、生理生化指標測定及16S rDNA序列分析，對從新疆天山凍土中篩選得到的產低溫蛋白酶菌株進行鑒定，確定其為Pseudomonas sp.(假單胞菌屬)N-8。通過單因素試驗和正交實驗對其發酵條件進行優化，確定最佳發酵培養基配方為(g/L):葡萄糖10，酵母粉8，酪蛋白20，K+0.4，pH 7.0。酶學性質研究表明，該菌產生的低溫蛋白酶最適作用pH為7.0，在pH 7.0～8.0呈現良好的穩定性;最適作用溫度為25℃，在25、35、45℃下均呈現良好的穩定性;金屬離子Cu2+、K+、Ca2+、Mn2+對酶活有一定的抑制作用，其中Cu2+抑制作用明顯，Fe2+、Mg2+、Na+、Zn2+對酶活力有不同程度的激活作用。

耐冷菌，低溫蛋白酶，酶學性質，假單胞菌屬

天山凍土屬于我國高海拔高山常年凍土，凍土環境中微生物會產生一系列適應低溫、寡營養、強輻射、凍融等極端因子的分子機制，為低溫微生物生理多樣性提供了可能[1］。低溫酶由于在低溫環境下具有較高的酶活性，有助于在保證催化效率的前提下降低反應溫度和縮短反應時間，從而大幅度節約能源[2］，因而在食品加工、日化產品、皮革加工等需要低溫催化的行業中具有較高的開發利用價值[3］。目前發現，產低溫蛋白酶的菌有假單胞菌屬(Psedomonas)[4］、黃桿菌屬(Flavobacterium)[5］、氣單孢菌屬(Aeromonas)[6］、希瓦氏菌屬(Shewanella)[7］、弧菌屬(Vibrio)[8］。這些低溫菌在永久性低溫環境下經過長期的進化適應，已有著適應低溫環境的特殊結構與生理生化機制。它們所產生的低溫蛋白酶也有著獨特的生理生化特征與結構特征。有關低溫微生物的資源勘探與代謝活性產物研究，已成為國際微生物學研究的熱點之一[9］，我國的一些研究機構也積極開展低溫蛋白酶生產菌株的篩選工作[10-11］。

本課題組從新疆凍土中篩選出1株產低溫蛋白酶的耐冷菌株，經鑒定為假單胞菌屬，對其發酵條件進行優化以提高其產酶能力，并對其所產低溫蛋白酶的粗酶酶學性質進行了初步研究，為極地微生物產低溫蛋白酶的研究打下一定的基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

樣品采自新疆天山冰川海拔3845 m處。沿2 m深的凍土剖面每隔20 cm取樣，迅速將其裝入已滅菌的保鮮盒內，置于車載冰箱保存，運回實驗室后，在超凈臺上削去表皮可能受到污染的樣品，于-20℃保存備用。

1.2 培養基

PYG富集培養基(g/L):蛋白胨0.5，酵母粉1，葡萄糖1，CaCl20.02，K2HPO4·3H2O 0.1，MgSO4·7H2O 0.04，NaCl 0.5，pH 7.2;

初篩培養基(g/L):蛋白胨0.05，酵母膏0.03，酪蛋白1，瓊脂1.5，pH 7.0;

發酵培養基(g/L):葡萄糖1，酵母粉0.4，酪蛋白1，MgSO4·7H2O 0.02，K2HPO4·3H2O 0.1，pH 7.0。

1.3 產低溫蛋白酶菌種的篩選

初篩:吸取富集后的培養液用倍比稀釋法制不同的稀釋度移入初篩平板中，涂勻，15℃培養。待菌落長好后，挑選透明圈較大菌株，斜面保存。

溫度復篩:以40℃為上限生長溫度[12］，即在該溫度不生長的菌株為耐冷菌。將初篩得到的產蛋白酶菌株在初篩平板上點樣，在40℃不生長的菌株，為試驗菌株。

蛋白酶活力的測定:按照SB/T10317—1999規定的福林(Folin)試劑顯色法測定酶活，進一步篩選出產酶能力強的菌株。底物2%的酪蛋白，pH 7.2磷酸鹽緩沖液，15℃反應10 min，660 nm處測定OD值，計算酶活力。在上述條件下，1 mL酶液每分鐘反應產生1 μg酪氨酸為1個酶活單位(U)。

1.4 菌種鑒定

1.4.1 菌落形態觀察、生理生化試驗

將所得菌株進行革蘭氏染色，在電鏡下觀察菌株形態，參考《伯杰細菌鑒定手冊》(第八版)[13］及《常見細菌系統鑒定手冊》[14］進行生理生化鑒定。

1.4.216S rDNA PCR擴增和序列分析

擴增引物為通用引物，

上游引物(F):5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，

下游引物(R):5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'。

PCR反應過程:94℃預變性4 min，94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸2 min，35個循環;72℃補齊10 min。用標準PCR反應體系進行PCR擴增。PCR產物電泳(1.0%瓊脂糖凝膠)，回收目的片段，純化產物連接pMD18-T載體，轉入感受態E.coli DH5α，LB/Amp/X-Gal/IPTG平板上挑選白斑，抽提質粒，PCR鑒定陽性重組菌，送上海博尚生物技術有限公司測序。

1.4.3 系統發育樹分析

利用CLUSTAL X將所測序列與Genbank中核酸序列進行比對，選用MEGA 5.0軟件Kimura 2-parameter距離模型進行neighbour-joining分析生成系統發育樹，并進行分析。

1.5 發酵條件優化

1.5.1 培養時間對菌體生長及產酶的影響

連續培養72 h，每隔6 h取1次樣，測菌體生長量(OD600nm)，同時制備粗酶液，測定酶活。

1.5.2 發酵溫度對菌體生長及產酶的影響

分別在10、15、20、25、30、35℃下進行搖瓶，考察不同發酵溫度對菌體生長和產酶的影響。

1.5.3 發酵培養基組成對產酶的影響

選取葡萄糖、酵母粉、酪蛋白、K+4個因子，采用4因素3水平正交表L9(34)設計正交實驗，考察培養基組成對產酶的影響。

1.5.4 發酵條件對產酶的影響

選取種齡、起始pH、接種量、裝液量4個因子，采用正交表L9(34)設計正交實驗，考察不同發酵條件對產酶的影響。

1.6 粗酶酶學性質的研究

1.6.1 粗酶的最適溫度和熱穩定性

最適溫度測定:將酶活力測定中的反應溫度分別控制在10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、65℃，其他條件不變，分別測定酶活。

熱穩定性測定:將粗酶液分別置于25、35、45、55℃，保溫15、30、45、60 min，冷卻后測酶活。

1.6.2 粗酶的最適pH和pH穩定性

最適作用pH測定:配置不同pH的緩沖液，并用相應緩沖液配置2%酪蛋白溶液作底物，測定酶活。

pH穩定性測定:將用不同pH緩沖液處理的酶液分別放置在25℃下保溫1 h后測酶活。其中pH 5.0～7.0用磷酸鹽緩沖液，pH 8.0～9.0用Tris-HCl緩沖液，pH 10.0～11.0用硼砂-氫氧化鈉緩沖液。

1.6.3 金屬離子對酶活的影響

不同金屬離子Fe2+、Mn2+、K+、Na+、Cu2+、Ca2+、Mg2+、Zn2+水溶液與等體積蛋白酶混合，使最終離子濃度為5 mmol/L，25℃反應15 min，測酶活性。

2 結果與討論

2.1 產低溫蛋白酶菌株的篩選

從天山凍土中通過酪蛋白平板法篩選到66株具有蛋白酶活性菌株，經溫度復篩及Folin法測定酶活，篩選得到5株產蛋白酶活力較高的耐冷菌株，結果如表1所示。由表1可以看出，菌株N-8所產蛋白酶酶活最高，選取該菌做進一步研究。

表1 產蛋白酶菌株篩選結果

2.2 菌種鑒定

2.2.1 菌落形態

該菌為革蘭氏陰性菌，菌體呈桿狀，細胞單個，大小為(0.5～0.8)μm×(2.0～3.2)μm，有莢膜，有鞭毛(見圖1);在酪蛋白平板上，菌落直徑3～4 mm，呈圓形，乳白色，不透明，表面光滑，邊緣整齊，易挑取，產生明顯的透明圈。

2.2.2 生理生化特性

由表2生理生化特性可以發現，該菌株接觸酶、精氨酸雙水解酶、硝酸鹽(還原)反應為陽性，能水解明膠，硫化氫試驗、伏-普二氏試驗(VP)、甲基紅試驗(MR)為陰性，不能發酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、纖維二糖、鼠李糖、棉子糖。

圖1 N-8菌株透射電鏡照片(5000×8)

表2 分離菌株的生理生化特性

2.2.3 系統發育樹分析

經PCR擴增后，該菌株16S rDNA片段長約1500 bp，將其16S rDNA序列同NCBI數據庫的相似序列進行同源性比較，如圖2所示。Blast分析顯示該菌與Pseudomonas extremaustralis 14-3在同一分支，二者序列相似性為99%。綜合菌株的形態特征、生理生化特性、16S rDNA序列以及系統進化樹的結果，可以將分離菌株歸為Pseudomonas屬，命名為Pseudomonas sp.N-8。

2.3 發酵條件優化

2.3.1 培養時間對菌體生長及產酶的影響

圖3顯示了培養時間對菌體產酶的影響。在對數生長期，雖然菌體生長旺盛，但酶活很低。隨著穩定期到來，酶活迅速升高。該菌在48 h酶活最高，隨著生長速度減慢，酶活也逐漸降低。從細菌生長曲線分析，酶的積累主要發生在對數生長后期，說明對數生長后期菌體不再大量繁殖，主要產生蛋白酶。因此酶的收獲應控制在細菌生長穩定期。

2.3.2 培養溫度對菌體生長及產酶的影響

圖2 菌株Pseudomonas sp.N-8及相關細菌16S rDNA序列系統發育樹

圖3 培養時間對菌體產酶的影響

圖4 顯示培養溫度對菌體產酶的影響。菌株在20℃菌體生長及產酶情況較好，溫度高于或低于此溫度菌體生長和產酶能力有明顯下降的趨勢。

圖4 培養溫度對菌體產酶的影響

2.3.3 發酵培養基組成對產酶的影響

極差分析結果表明(表3)，各因素對產酶的影響大小順序為:酪蛋白＞酵母粉＞葡萄糖＞K+;最佳培養基配方為(g/L):葡萄糖10，酵母粉8，酪蛋白20，K+0.4;按最佳組合測定發酵液酶活為47.34 U/mL。

2.3.4 發酵條件對產酶的影響

極差分析結果表明(表4)，各因素對產酶的影響大小順序為:種齡＞起始pH＞接種量＞裝液量;最佳培養條件為:種齡24 h，起始pH 7，接種量4%，裝液量50 mL/250 mL。按最佳組合測定發酵液酶活為49.56 U/mL。

表3 培養基組成的正交試驗設計與結果

表4 發酵條件的正交試驗設計與結果

2.4 粗酶酶學性質研究

2.4.1 粗酶的最適溫度

溫度對Pseudomonas sp.N-8產低溫蛋白酶活力的影響結果如圖5所示。該酶在10℃時可保持約60%的相對酶活，隨著溫度的升高，酶活逐漸提高，在25℃酶活最高，高于此溫度酶活開始下降。在溫度20～30℃范圍內，低溫蛋白酶都能保持較高的酶活，溫度超過40℃，酶活急劇下降，65℃時酶活不足最高酶活的10%。因此，N-8所產蛋白酶的最適溫度為25℃。

2.4.2 熱穩定性

圖5 酶的最適溫度

菌株N-8所產低溫蛋白酶熱穩定性如圖6所示。該酶在25℃呈現良好的穩定性，保溫60 min仍可保持95%的酶活;在35、45℃保溫45 min酶活喪失了20%左右;在55℃下保溫30 min后酶活喪失了75%。這與報道的低溫蛋白酶熱穩定性相符，即在較高溫度下(＞50℃)酶可快速失活[2，3］。

圖6 酶的熱穩定性

2.4.3 粗酶的最適pH

pH對Pseudomonas sp.N-8產低溫蛋白酶活性的影響結果如圖7所示。菌株N-8所產低溫蛋白酶最適pH為7.0，在pH 7.0～7.5范圍內保持較高酶活。在酸性或堿性環境中，酶活大幅度下降。故菌株N-8所產低溫蛋白酶為中性蛋白酶。

圖7 酶的最適pH值

2.4.4 pH的穩定性

菌株N-8所產低溫蛋白酶pH穩定性如圖8所示。菌株N-8所產低溫蛋白酶pH在7.0～8.0范圍內相對酶活達到90%以上，在pH 5.0時酶活下降約40%，在pH 10.0時酶活下降約25%。說明菌株N-8所產低溫蛋白酶在pH 7.0～8.0范圍內呈現較好的穩定性。

圖8 酶的pH穩定性

2.4.5 金屬離子對酶活的影響

金屬離子對Pseudomonas sp.N-8產低溫蛋白酶活性的影響結果如圖9所示。K+、Cu2+、Ca2+、Mn2+對蛋白酶有不同程度的抑制作用，其中Cu2+的抑制作用明顯;Fe2+、Mg2+、Na+、Zn2+對蛋白酶有不同程度的激活作用。

圖9 金屬離子對酶活的影響

3 結語

低溫蛋白酶主要由生存在低溫冷凍環境中的微生物產生，目前大多數產酶菌株是從南、北極和常年恒定在低溫的極端環境中分離而得。本課題從新疆天山長年冷凍的土壤中分離獲得1株產低溫蛋白酶的菌株，經鑒定為Psedomonas屬，并對其生長、產酶條件和粗酶性質做了初步研究。報道低溫蛋白酶的最適酶活溫度大部分為15～40℃，如史勁松等報道耐冷菌株SYP-A2-3所產低溫蛋白酶的最適酶活溫度為15℃[15］，徐國英等報道Pseudoalterom onas sp.QI-1(假交替單胞菌屬)所產蛋白酶的最適酶活溫度為40℃[16］。本研究分離菌株產低溫蛋白酶的最適溫度為20℃，酶活最適作用溫度為25℃，55℃保持30 min酶活喪失75%，65℃下作用酶活僅保留不到10%。本文篩選的菌株為今后低溫酶的嗜冷機制研究及其在食品、洗滌劑、化妝品、皮革等工業上的應用研究奠定基礎。

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ABSTRACTAstrain producing the cold-adapted protease has been isolated from the frozen soil of the Tianshan Mountains，China.Based on the morphological，physiological，biochemical properties and 16S rDNA sequence analysis，the strain was identified as Pseudomonas sp.N-8.Fermentation conditions were optimized by single factor and orthogonal experiments.The optimal medium components were determined as follows:10 g/L glucose，8 g/L yeast powder，20 g/L casein，0.4 g/L KH2PO4，pH 7.0.The research on the properties of crude enzyme showed that the optimal pH and temperature for activity were 7.0 and 25℃，respectively.As to the thermal stability of the cold-adapted protease，it was stable over the range of 25～45℃.The test of pH stability indicated that the cold-adapted protease was more stable within pH 7.0～8.0.The protease activity was inhibited by Cu2+，K+，Ca2+，and Mn2+，but it was stimulated by Fe2+，Mg2+，Na+，and Zn2+.

Key wordspsychrotrophs，cold-adapted protease，enzymatic properties，Psedomonas

Screening，Identification of Pseudomonas sp.N-8 producing Cold-adapted Protease and the Study on Enzymatic Properties

Qi Dan-dan1，Yang Rui-jin2，Hua Xiao2，Shen Lian-lian1，Zhang Wen-bin2，Zhao Wei2
1(State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)
2(School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

碩士研究生(楊瑞金教授為通訊作者)。

*江蘇省自然科學基金“疏水納米微環境中β-半乳糖苷酶轉糖基反應機制的研究”(編號BK2011149)，以乳糖異構化為目標的葡萄糖異構酶定向改造研究中高通量篩選模型的建立(其他)

2012-03-20，改回日期:2012-04-27