以木薯渣水解液為碳源固定化發酵產丁酸工藝的研究*

王金，蔡謹，施周銘，黃磊，徐志南

(浙江大學化學工程與生物工程學系，浙江杭州，310027)

以木薯渣水解液為碳源固定化發酵產丁酸工藝的研究*

王金，蔡謹，施周銘，黃磊，徐志南

(浙江大學化學工程與生物工程學系，浙江杭州，310027)

利用廉價的非糧原料及采用新型高效的固定化發酵技術對于實現丁酸的工業化發酵生產具有重要意義。文中研究了纖維床生物反應器組成形式對固定化酪丁酸梭菌產丁酸過程的影響，結果表明，采用纖維床生物反應器四柱并聯發酵時，丁酸終濃度比單柱發酵提高7.19%，尤其是產率提高了136.7%。以木薯渣水解液為碳源，利用纖維床生物反應器四柱并聯進行丁酸批次發酵和補料發酵。批次發酵產丁酸濃度達到25.2 g/L，得率0.46 g/g，采用補料發酵，丁酸終濃度可達61.4 g/L。

固定化發酵，木薯渣水解液，丁酸，補料發酵

丁酸是一種重要的短鏈脂肪酸，在食品、化工、醫藥等方面有重要的應用[1］。以其為前體生產的脂類可以用作食品添加劑來增加食物的香味。丁酸還能用于醫藥中間體的制備，如(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯是用于合成多種血管緊張素轉化酶抑制劑的重要中間體，可用于治療高血壓和充血性心力衰竭等心血管疾病。此外，丁酸鈉鹽還可作為替代抗生素的飼料添加劑飼喂家禽，以促進生長。

目前，丁酸的工業生產以化學合成法為主，其中以間歇式丁醛氧化法[2］最為普遍，但其工藝復雜，環境污染嚴重。隨著化石性資源日漸枯竭，傳統化工造成環境污染以及人們對生物基化學品需求的快速增加，化學工業呈現出從石油基到生物基的轉變趨勢。另外，由于丁酸和下游衍生產品有相當比例應用于食品、飼料和醫藥等行業，從生物質出發經生物合成的丁酸(即生物丁酸)更受歡迎。目前，相關的研究僅限于實驗室，尚未實現工業化生產。其中主要問題是生物發酵法生產丁酸存在原料成本高、單位體積產量低和生產效率低等缺點，使其始終無法替代化學合成法。因此，研究人員一方面需要尋找和利用廉價的基質原料，另一方面需要探索高效穩定的發酵工藝。

為了降低發酵法生產丁酸的成本，研究者曾嘗試利用各種廉價原料和廢棄物發酵生產丁酸，如乳清[3］、玉米芯水解液[4］、玉米粉以及廢糖蜜[5］等。木薯渣是木薯提取淀粉后的廢棄物。目前全國每年產生的木薯渣為30萬t左右，除少量被用作飼料外，大量被廢棄，不僅造成資源浪費，還帶來環境污染問題。雖然以木薯淀粉及其水解物為發酵底物的研究很多[6-8］，但利用木薯渣水解液作為發酵底物的研究[9-11］較少。

利用纖維床生物反應器[12］固定化發酵有利于提高發酵的產物濃度和生產效率。但是，目前這種反應器的應用僅限于實驗室小規模，且單個使用，發酵周期相對較長。

本文針對以上兩個問題，研究了多柱式纖維床生物反應器固定化發酵產丁酸的可行性，并探索了以木薯渣水解液為碳源多柱式纖維床生物反應器固定化發酵產丁酸的工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum ZJU8235)，由浙江大學生物工程研究所選育和保藏。

葡萄糖，中國醫藥集團上?；瘜W試劑公司;硫酸銨、磷酸氫二鉀、鹽酸半胱氨酸鹽、硫酸亞鐵，上海生工生物工程有限公司;刃天青，Sigma公司;酵母粉、蛋白胨，BBI公司。

立式壓力蒸汽滅菌鍋、HHS型電熱恒溫水浴鍋，上海博迅實業有限公司醫療設備廠;AnkeTGC-16C離心機，上海安亭科學儀器廠;YQX-II厭氧培養箱，上海躍進醫療器械廠;5L體系發酵罐，德國B-Braun公司;6820氣相色譜儀系統，Agilent Technology公司;紫外/可見分光光度計，Amershan Biosciences公司;AL104電子天平MP120-BLE便攜式酸度計，Mett-ler Toledo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 木薯渣的預處理

在高壓蒸汽(121℃)條件下，木薯渣與0.3 mol/L H2SO4固液比1∶10，水解反應30 min。將得到水解反應液調pH至6.0，過濾得濾液，測定其還原糖含量。

1.2.2 培養基的配制

種子培養基(1 L):30 g葡萄糖，5 g酵母粉，5 g蛋白胨，3 g(NH4)SO4，1.5 g K2HPO4，0.6 g Mg2SO4，0.03 g FeSO4，0.3 g半胱氨酸-HCl(作為還原劑)，0.5 mL 0.1%刃天青(作為無氧指示劑)，在沸水浴中煮沸除氧，培養基在121℃下滅菌30 min。培養條件為37℃，pH6.0。發酵培養基中碳源為60 g/L葡萄糖或者木薯渣水解液，其它成分與種子液相同。充氮氣，保持罐中無氧環境。

1.2.3 利用纖維床生物反應器系統進行丁酸發酵

纖維床生物反應器的制作方法見文獻[3］。本文設計的纖維床生物反應器發酵系統由一個5 L的機械攪拌式預發酵罐、1～4個500 mL的相互串聯或并聯連接的纖維床生物反應器以及pH控制器、循環水保溫系統、供氮氣瓶等組成。纖維床生物反應器和罐體構成一個循環回路(見圖1)。整個發酵系統在121℃下滅菌30 min，通無菌氮氣使罐內達到厭氧狀態，接入100 mL種子液于5 L發酵罐內(裝液量為2 L)，攪拌轉速控制在 150 r/min，溫度 37℃，維持pH6.0。待發酵罐中OD值達到4.0時即開啟纖維床生物反應器，初始循環速度為60 mL/min，12 h后，流速提高到120 mL/min。

圖1 多柱并聯固定化發酵裝置圖

以葡萄糖為碳源進行了多柱串并聯纖維床生物反應器發酵產丁酸的動力學研究。批次發酵時每當發酵液中碳源濃度接近0時，即放料并補入無菌新鮮培養基進行下一批次發酵。補料發酵是當碳源濃度接近0時，補入高濃度葡萄糖液，直至丁酸產量不再提高。

在以上基礎上，進行以木薯渣水解液為碳源的纖維床生物反應器發酵產丁酸的動力學研究。在批次發酵過程中，當發酵液中糖濃度接近0時即補入以木薯渣水解液為碳源的新鮮培養基。補料發酵時，每當碳源濃度接近0時即補入濃縮的木薯渣水解液。每隔4h取樣檢測細胞濃度、底物濃度以及產物含量。

1.3 分析方法

1.3.1 菌體含量測定

用分光光度計測定600 nm下的吸光值。

1.3.2 還原糖含量測定

將發酵液10000 r/min離心5 min后稀釋20～100倍，采用DNS法測定其中的還原糖含量。

1.3.3 丁酸和乙酸測定

采用安捷倫6820型氣相色譜系統檢測，以內標法定量分析發酵液中丁酸和乙酸濃度。發酵液經10000 r/min離心后取上清液1 mL，加入內標物丙酸30 μL，進樣量0.4 μL，檢測所用流動相為高純氮氣，色譜柱為HP-INNOWAX毛細管柱(30 m×0.32 mm)，檢測器為氫火焰離子化檢測器，流速為3 mL/min。測定條件:柱溫250℃，FID檢測器，進樣口溫度250℃。

2 結果和討論

2.1 多柱串并聯固定化發酵產丁酸工藝研究

生物丁酸只能利用酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)等厭氧微生物經厭氧發酵獲得。固定化發酵被證實能有效降低發酵成本并大幅提高厭氧發酵的產物終濃度。美國俄亥俄州立大學的楊尚天教授等人在傳統的填充床反應器(packed bed reactor，PBR)的基礎上設計出一種簡單、高效的纖維床生物反應器，適用于厭氧性微生物發酵。但是，目前這種反應器的應用僅限于實驗室小規模(反應器體積小于1 L)，若單純放大體積，將無法解決復雜的多相傳質問題和填充物強度不足等問題。本文嘗試在此基礎上，通過數個纖維床生物反應器的串聯或并聯，以提高固定化發酵產丁酸的反應效率。

所謂的串聯是前一個纖維床生物反應器的物料出口與下個纖維床生物反應器的物料進口依次連接，形成串聯式纖維床生物反應器;而并聯是所有纖維床生物反應器的物料進口并聯成一個共同的物料進口，所有纖維床生物反應器的物料出口并聯形成一個共同的物料出口，形成并聯式纖維床生物反應器。在各個纖維床生物反應器的物料進口和物料出口管道上設置泵和流量計，將預發酵罐的出料口與多聯纖維床生物反應器的物料進口相連接，預發酵罐的進料口與多聯纖維床生物反應器的物料出口相連構成封閉循環系統。實驗中以葡萄糖做碳源分別進行了2～4個纖維床生物反應器相互串聯或相互并聯發酵產丁酸的動力學研究，并與單柱式纖維床生物反應器發酵產丁酸進行比較，結果見圖2。

圖2 多柱串并聯固定化發酵葡萄糖產丁酸結果比較

從圖2中可以看出，隨著柱子數量的增加，丁酸終濃度不斷增加，相應產率大幅提高。四柱并聯與單柱發酵相比，丁酸終濃度提高7.19%，產率提高136.7%。另外，柱子數量的增加與丁酸得率的增長呈現一定程度的正相關。這可能是由于固定的菌體占總菌體量比例較大，因而營養物質流向細胞生長方向的較少。串聯模式未能明顯提高發酵液中丁酸濃度。雙柱并聯與串聯相比，產率高出69.32%?？赡苁且驗榇撃Ｊ较屡囵B基流動阻力較大，且流動過程中pH值降低造成產酸速率較低。

2.2 木薯渣水解液為碳源四柱并聯批次發酵產丁酸工藝

木薯渣經上述預處理得到木薯渣水解液，經DNS法測定，其還原糖濃度為55.4 g/L。以木薯渣水解液為葡萄糖的替代碳源，有利于進一步降低發酵成本。本文以木薯渣水解液為碳源進行了四柱并聯固定化反復批次發酵產丁酸動力學研究，結果如圖3所示。對全部6個批次的發酵參數進行比較，結果如圖4所示。在6個批次的丁酸發酵過程中沒有明顯的滯后期，當新鮮培養基加入后，還原糖在30 h左右就被耗盡，丁酸平均濃度達到25.2 g/L，6個批次中丁酸的得率為0.46 g/g。丁酸的發酵周期平均為32 h。前3個批次周期逐漸縮短，達到穩定。這可能是由于前2個批次纖維床生物反應器上的菌體固定量還沒有達到最大，隨著批次的增加，菌體密度逐漸增大，生產效率越來越高。利用木薯渣水解液批次發酵產丁酸的最高得率達0.52 g/g，超過了酪丁酸梭菌發酵葡萄糖產丁酸的理論得率0.489 g/g。這可能是由于木薯渣水解液中的蛋白質等其它營養成分也能轉化成為丁酸發酵的底物。

圖3 以木薯渣水解液為碳源四柱并聯固定化反復批次發酵產丁酸動力學

圖4 木薯渣水解液批次發酵產丁酸結果比較

以木薯渣水解液為碳源固定化批次發酵產丁酸的終濃度明顯高于先前報道的以葡萄糖或木糖[13］為碳源的固定化批次發酵的丁酸終濃度?？赡苁怯捎谀臼碓庖褐泻幸恍┖铣膳囵B基中沒有的、有益于促進發酵的天然成分，如生長因子等。

與細胞膜過濾回收發酵相比，該方法解決了發酵的長期穩定性操作問題，避免了膜堵塞和污染問題。同時，使用FBB固定化發酵系統能夠消除滯后期，同時能夠連續多批次生產丁酸而不用接種新鮮種子液。由于使用FBB固定化發酵系統菌體生長較游離時要少，因此獲得了較高的丁酸得率。另外一個可能存在的問題是木薯渣水解液中存在一些較小的不溶的固形顆?？赡軙氯鸉BB中纖維織物之間的孔隙，然而經過6個批次的發酵流速和發酵情況沒有受到嚴重的影響。這可能是由于填充材料的孔隙足夠讓水解液中的細小顆粒通過。

2.3 木薯渣水解液為碳源四柱并聯補料發酵產丁酸工藝

補料發酵工藝可以增強丁酸梭菌對丁酸的耐受性。并且通過補料提高發酵液中丁酸的終濃度有利于降低后續分離成本。采用濃縮木薯渣水解液進行丁酸補料發酵的動力學研究。結果如圖5所示。

圖5 以木薯渣水解液為碳源四柱并聯固定化補料發酵產丁酸動力學

每當發酵液中糖的濃度接近于0時，即補入濃縮的木薯渣水解液。隨著補料發酵的進行，丁酸濃度不斷提高。在發酵到220 h時，丁酸濃度達到61.4 g/L，遠高于上述批次發酵中的25.2 g/L。補料初始階段，丁酸濃度增長較快。在丁酸濃度達到40 g/L后得率和產率下降。這說明，隨著發酵液中產物濃度的升高，產物抑制作用變得明顯。

使用木薯渣水解液補料發酵產丁酸的總產率略低于以葡萄糖做碳源時四柱并聯發酵產丁酸，這可能是產物抑制和木薯渣水解過程產生的有害物質積累共同作用的結果。如果我們對木薯渣水解過程可能產生的糖醛酸、酚類等物質進行分離，將有可能進一步提高其丁酸發酵水平。

3 結論

采用四柱并聯纖維床生物反應器固定化酪丁酸梭菌發酵產丁酸的發酵模式是切實可行的。相比于單柱式纖維床生物反應器發酵，其丁酸濃度和產率分別提高7.19%和136.9%。這種模式將有利于解決纖維床生物反應器單純體積放大時造成的多相傳質問題和填充物強度不足等問題。尤其在后續中試及工業化過程中更多纖維床生物反應器并聯發酵產丁酸的模式值得繼續探索。以木薯渣水解液為碳源進行纖維床生物反應器四柱并聯補料發酵，丁酸終濃度達到61.4 g/L。這一結果優于先前報道的采用葡萄糖[12］、玉米芯水解液[4］、廢糖蜜[5］為碳源時固定化發酵產丁酸的水平。說明木薯渣水解液是一類既成本低廉，又適合于酪丁酸梭菌固定化發酵產丁酸的優質碳源。

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ABSTRACTAs butyric acid is an important chemical raw material，using cheap non-grain biomass and FBB(fibrous-bed bioreactor)immobilized fermentation to produce butyric acid has important significance.The investigation showed that the four-column parallel immobilized fermentation technology can greatly improve the production efficiency due to the decrease of fermentation recycle to half.In the fermentation with cassava dregs hydrolysate as substrate，25.2 g/L butyric acid was obtained and the yield was 0.46g/g.At last，the production of butyric acid was increased to 61.4g/L through fed-batch fermentation.

Key wordsbrous-bed bioreactor，cassava dregs hydrolysate，butyric acid，fed-batch

Production of Butyric Acid from Casaba Dregs Hydrolysate by Immobilized Clostridium tyrobutyricum in Fibrous-bed Bioreactor

Wang Jin，Cai Jin，Shi Zhou-ming，Huang Lei，Xu Zhi-nan
(Department of Chemical Biological Engineering，Zhejiang University，Hangzhou 310027，China)

碩士研究生(蔡謹教授為通訊作者，E-mail:caij@zju.edu.cn)。

*國家高技術研究發展計劃(863計劃)(2009AA02Z206)

2012-04-03，改回日期:2012-05-31