抗草甘膦轉基因大豆DNA標準分子構建及多重熒光PCR檢測體系的建立

賴心田 劉小青 洪曉明 陳國培 楊國武

(深圳市計量質量檢測研究院 廣東深圳 518131)

1 前言

近十幾年來，隨著轉基因作物及其加工產品在數量和應用上的逐漸增多，轉基因產品及其安全性受到了越來越多的關注［1］，同時也給轉基因生物安全監管工作帶來更大的挑戰。不少國家已經對轉基因食品進行了限量標識管理，我國也建立了轉基因食品的標識管理目錄，并納入了檢驗檢疫和質檢部門的檢測項目。

目前轉基因大豆的檢測主要是采用普通PCR和單重熒光定量PCR進行，然而隨著TaqMan探針技術的發展［2，3］，多重定量 PCR不僅能節省樣品及試劑，同時也能實現一管多檢的高效率［4－6］。此外，進行轉基因作物及其產品的PCR檢測使用重組質粒，可以長期穩定保存并與目的基因保持較高同源性，因此，將檢測的目的基因片段克隆到質粒載體中制備成陽性參照物，不僅可以使陽性參照物長期穩定保存，而且使檢測結果的準確性得到很大的提高［7］。

由于抗草甘膦轉基因大豆外源基因的檢測包括3個部分:花椰菜花葉病毒的CaMV35S啟動子、胭脂堿合成酶的NOS終止子以及5－烯醇丙酮酸莽草酸 －3 － 磷酸合成酶基因 CP4 EPSPS［8］，因此，本研究旨在構建穩定、可靠、易制備和保存的抗草甘膦轉基因大豆陽性標準分子，建立抗草甘膦轉基因大豆的多重熒光PCR檢測體系，實現一次PCR反應完成篩選和特異性檢測的過程。

2 材料與方法

2.1 材料

轉基因抗草甘膦大豆標準品為美國孟山都公司的RRS轉基因大豆GTS40－3－2。實驗所用的PCR引物和熒光探針由上海生工生物工程公司合成和標記，所用的分子生物學試劑均購自大連寶生物生物工程公司。

2.2 方法

2.2.1 RRS 外源基因片段克隆

取適量RRS轉基因大豆標準品，研磨成粉狀，采用CTAB法提取大豆基因組，用紫外分光光度計測量其含量，并稀釋至50ng/μL作為PCR擴增模板。在PCR擴增中，利用連接引物、CaMV35S、CP4 EPSPS和NOS引物將3個外源基因片段串聯在一起并克隆至PMD－18T載體上，構建的質粒命名為PMD18T/SOY，并送上海生工測序。構建及檢測中用到的引物［9］如表1所示。

表1 引物表

2.2.2 三重實時熒光PCR體系構建

CaMV35S，CP4 EPSPS，NOS 的熒光引物和探針序列［10］見表2。提取上述構建好的 PMD18T/SOY質粒，并用RNAse消化RNA后稀釋至10ng為模板，同時設立空白對照，進行三重熒光PCR，引物和探針濃度均為20mmol/μL，通過調整Mg2+，酶的濃度，引物和探針的量，最終獲得25μL如下的三重熒光的體系:2.5μL 10 × r － taq buffer，3μL dNTP 2ulMg2+，13.3μL ddH2O，0.4μL 各引物，0.2μL 各探針，0.2 μL r－ taq 酶，1μL 10ng/μL 質粒。熒光PCR的反應條件為:95℃，3min;95℃，15s;60℃，34s;40cycle。

表2 實時熒光PCR引物及探針表

2.2.3 三重熒光定量PCR的檢測限值測定

以10ng/μL的PMD18T/SOY質粒進行10倍梯度稀釋，質粒濃度分別為 10、1、10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6ng/μL，采用 25μL 體系，體系同2.2.2，同時做陰性空白對照，進行三重熒光定量PCR檢測限值的測定。

3 結果與分析

3.1 RRS外源基因片段克隆

通過設計的中間引物，將抗草甘膦轉基因大豆的CaMV35S、CP4 EPSPS和NOS 3個外源基因融合在一起，采用CaMV35S正向引物和NOS反向引物，以PMD18T/SOY質粒為模板經過PCR擴增后，產物擴增片段堿基理論長度應為549bp，檢測結果見圖1。

圖1 PMD18T/SOY檢測結果

圖1 顯示，擴增條帶大小約為550bp，與理論長度一致。PMD18T/SOY質粒插入片斷經測序分析與標準序列一致，證實PMD18T/SOY構建成功，可用于轉基因定性檢測及限值檢測的陽性參照物。

3.2 三重實時熒光PCR體系建立及檢測限值的測定

經過調整Mg2+、酶的濃度、引物和探針的量獲得大于90%的高擴增效率和重復性一致的三重熒光PCR體系，采用構建好的 PMD18T/SOY質粒10ng為模板，獲得的結果如圖2所示。

圖2 三重熒光PCR檢測結果

從圖2中可看出，CaMV35S、CP4 EPSPS和NOS的Ct值接近，空白無污染，建立的三重熒光PCR體系適合對以該質粒為陽性參照進行的轉基因定性檢測。此外，以10ng/μL的質粒為母液，并進行10倍梯度稀釋進行CaMV35S、NOS和CP4 EPSPS三重熒光PCR檢測限值分析，擴增曲線見圖3。以質粒濃度的log值為橫坐標，以Ct值為縱坐標，建立擴增基因的標準曲線圖，見圖4。

圖3 三重熒光PCR CaMV35S、NOS和CP4 EPSPS檢測限值測定結果

圖4 三重熒光PCR CaMV35S、NOS、CP4 EPSPS基因標準曲線

圖3 和圖4顯示，3個基因的熒光PCR每個循環呈等差的3－4Ct值增加，Ct值介于13－30之間，且這3個基因的熒光PCR檢測限值均為10－3ng/μL，即能檢測到1pg的DNA，靈敏度特別高。并且圖4中CaMV35S、NOS和CP4 EPSPS的r2值分別為0.998、0.999、0.999，這也說明梯度稀釋的質粒模板擴增線性相關性非常好。

4 討論

使用PMD18T/SOY作為參比分子時，構建的多重熒光定量PCR體系靈敏度極高，可對抗草甘膦轉基因大豆進行定性和定量檢測。但是，高靈敏度的同時也帶來一定的風險性，如果有微量轉基因物質氣溶膠存在，則很容易造成污染，使空白在Ct值為30多時有峰揚起，因此，需嚴格控制熒光定量PCR體系配制區與模板加樣區的隔離，避免氣溶膠等的存在，從而避免出現假陽性。

歐盟聯合研究中心標準物質與測量研究所(Institute for Reference Materials and Measurements，IRMM或者ERM)提供的抗草甘磷轉基因大豆GTS40－3－2標準物質是 5%、2%、1%、0.5%、0.1%和0%6個濃度梯度的種子粉末，由于不同種子在提取的DNA質量、純度和復雜程度上很難保持一致，容易導致PCR擴增效率的差異，這都會對轉基因成分定量分析的準確度產生一定的影響。此外，種子作為標準物質進行定量檢測重復性難以控制，線性相關性也較差。在本研究中，將融合了抗草甘膦轉基因大豆的CaMV35S、CP4 EPSPS和NOS 3個外源基因的質粒PMD18T/SOY作為標準物質分子，并在此基礎上建立多重熒光PCR，實現一管多檢，定量檢測未知樣品時可稀釋到10－6，檢測限值達10－3ng/μL，線性關系良好且范圍寬，作為參比分子非常精確，在建立的多重熒光PCR中，它的r2均在0.998以上。同時，作為標準分子的質?？梢酝ㄟ^微生物進行大量培養，DNA易于擴增，可提供無限穩定量的標準物質，一個標準分子可以同時包含多個外源目的基因，并且純度較高。因此與常規的從生物公司購買標準品相比，此方案更具有操作性，更能保證目的片段的擴增效率，降低了轉基因檢測的成本。

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