順鉑對肝癌HepG2細胞增殖抑制作用的實驗研究

周麗霞，楊 森，那文婷，陸 莉，王譯擘，吳 玨，張 巍 (吉林醫藥學院:.臨床醫學院，.基礎醫學院，3.生化教研室，吉林 吉林 303)

肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，死亡率高。對于肝癌的治療手段主要有手術治療、放療和化療等，其中化療是綜合治療的主要手段之一，而腫瘤細胞增殖的研究是評價化療藥效的一個重要指標［1-2］。順鉑(cisplatin，DDP)是一種用于化療的鉑制劑，并且在多種實體瘤的治療中顯示了確切的療效。臨床上順鉑的應用已有很久的歷史，1969年Rosenberg首次報道了順鉑的抗癌效應［3］，但是其單獨用藥對肝癌HepG2細胞抑制作用的實驗研究則不多見。因而本實驗研究順鉑對肝癌HepG2細胞增殖的影響，從而為順鉑的抗肝癌作用提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

HepG2細胞由吉林醫藥學院免疫教研室惠贈;順鉑購自山東齊魯藥業公司;MODEL 550型酶標儀(BIO-BAD公司);LXJ-Ⅱ型離心沉淀機(上海醫用分析儀廠);H110D電子分析天平(美國Sartorius);倒置顯微鏡(上海醫用分析儀廠)。

1.2 細胞培養

HepG2細胞培養在含10%新生小牛血清的完全培養液中培養于37℃、5%的CO2培養箱中，細胞呈貼壁狀態生長，在倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況并拍照，適量時進行細胞傳代。

1.3 MTT比色法測CDDP的抑制率

取對數生長期的HepG2細胞，調細胞懸液密度為1×104個/mL，按100μL/每孔接種于96孔培養板。并用順鉑與完全培養液配制成5、10、15、20 μg/mL不同的濃度培養，設置不加藥的對照組和不加MTT的空白對照組，復孔數為3。待細胞貼壁后棄去培養液，給藥后培養24 h，期間在倒置顯微鏡下密切注意觀察細胞生長狀態并拍照。24 h后每孔加入20 μL MTT［4］37 ℃ 孵育 4 h，棄去上清后每孔加150 μL DMSO(二甲基亞砜)，在搖床上低速振蕩10 min，酶標儀570 nm波長測得吸光度值并記錄結果。利用標準曲線計算 IC50［5］。

1.4 統計學分析

對全部數據采用統計學分析，組間采用t檢驗處理。

2 結果與討論

2.1 倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化

順鉑對肝癌HepG2細胞生長的抑制作用的形態觀察見圖1。在顯微鏡下可見未加順鉑細胞生長狀態良好，加順鉑后在顯微鏡下觀察細胞體積縮小，連接消失，與周圍細胞脫離，生長狀態極差。

2.2 順鉑對HepG2細胞增殖的影響

不同濃度順鉑處理Hela細胞24h后采用MTT法測得各組吸光度，計算順鉑對肝癌HepG2細胞生長的抑制率，結果表明肝癌細胞的抑制率對順鉑的濃度呈明顯劑量相關性，順鉑的濃度分別為5 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL、20 μg/mL。以空白組做對照，測得各組OD值(見圖2)。從圖中可看出不同濃度順鉑對肝癌HepG2細胞的生長均有抑制作用，各組與對照組比較有顯著差異(P＜0.05或P＜0.01)。通過標準曲線可計算出順鉑對HepG2細胞的IC50為8.97 μg/mL。

3 討論

順鉑為治療多種實體瘤的一線藥［6］，順鉑為無機水溶性鉑類絡合物，分子結構中鉑原子發揮重要作用，可與DNA分子中鳥嘌呤或嘧啶堿基結合，形成DNA鏈內或鏈間交聯，影響DNA合成與復制，抑制癌細胞分裂。順鉑的多方面臨床作用與其具有強氧化性有關，DDP的強氧化性能夠有效阻斷細胞增殖的過程，抑制細胞分裂，同時能夠誘導原有腫瘤細胞多種凋亡蛋白表達，促進其最終走向死亡［7］。有研究表明，順鉑可以通過細胞特異性Caspases依賴的信號途徑誘導凋亡，發揮殺瘤效應［8］。Caspases是凋亡信號轉導的共同通路，許多調控細胞凋亡的因素都通過Caspases酶系起作用的。其中Caspase-3為凋亡的效應因子，負責對凋亡途徑最后執行階段的全部或部分關鍵性蛋白酶的剪切，被稱為凋亡的“執行者”［9-10］。

圖1 不同濃度的順鉑對Hepg2細胞形態的影響:A.對照組;B.5 μg/mL;C.10 μg/mL;D.15 μg/mL;E.20 μg/mL

圖2 不同濃度順鉑對HepG2細胞增殖的影響

腫瘤共同的生物學特征是失控性生長，其主要分子機制是細胞周期紊亂導致細胞增生過多和凋亡減少，因此抑制腫瘤細胞增殖，誘導其凋亡已成為腫瘤治療的重要手段之一［11］。因此本實驗選用形態學觀察及MTT法對其抗增殖及誘導凋亡進行初步的測定，測定出順鉑對肝癌HepG2細胞最佳的作用劑量。在顯微鏡下可見未加順鉑時細胞生長狀態良好，加順鉑后細胞生長受抑制，生長狀態差，在顯微鏡下細胞皺縮，且具有劑量依賴性。本研究結果顯示:順鉑對肝癌HepG2細胞有抑制增殖作用，但其在誘導肝癌細胞凋亡的過程中，凋亡相關基因的變化及凋亡信號的產生還有待深入研究，以進一步闡述順鉑的作用機理。

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