PCR-焦磷酸測序技術檢測奶牛乳房炎4種主要致病菌方法的建立

劇慧棟，李月穎，張樂祎，李秀娟，趙寶華，徐保紅*

(1.石家莊市疾病預防控制中心，河北 石家莊 050011;2.河北師范大學，河北 石家莊 050024)

奶牛乳房炎是奶牛的一種多發病和常見病，是由多種致病微生物引起的局部病變，對奶牛養殖業造成了巨大損失。據統計，能引起奶牛乳房炎的微生物主要是細菌，以無乳鏈球菌(Streptoco-ccus agalactiae)、停乳鏈球菌(S.dysgalactiae)、沙門菌(Salmonella sp.)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)感染居多［1-2］。PCR-焦磷酸測序技術是近幾年發明的一種實時DNA序列分析技術，以快速、準確、實時分析DNA序列見長，使用該技術可以在很短的時間內，得到大通量的待測菌的基因序列，從而鑒定出引起奶牛乳房炎的致病菌種類［3-4］。本文采用生物信息學分析技術確定了無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的具有相對保守區域的特異性基因，對所選基因進行了序列比對和分析，以使所獲的基因更具有代表性，避免或減少假陽性和假陰性結果的產生。為了驗證PCR-焦磷酸測序方法的準確性，選取了大量的目的菌株和參照菌株進行了重復性驗證，結果表明應用PCR-焦磷酸測序方法對上述奶牛乳房炎4種主要致病菌的檢測準確率非常高，沒有出現一例漏檢和誤檢。因此，該方法的建立為奶牛乳房炎致病菌的檢驗工作提供了一種新的更加準確、快速的檢驗手段［5-8］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 無乳鏈球菌108株，停乳鏈球菌類馬亞種100株，沙門氏菌136株，金黃色葡萄球菌203株，乳房鏈球菌(Streptococcus agalactiae)、大腸埃希菌(Escherichia coli)、腸侵襲大腸埃希菌(Enteroinvasive E.coli)、腸毒性大腸桿菌(Enterotoxigenic E.coli)、腸出血性大腸埃希菌、腸致病大腸埃希菌(Enterohemorrhagic E.coli)、產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)、陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)、阪崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii)、無害李斯特菌(Listeria innocua)、單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)、假結核耶爾森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)、小腸結腸炎耶爾森菌(Yersinia enterocolitica)、產酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)、肺炎克雷伯菌(K.peneumoniae)、假單胞桿菌(Pseudomonadaceae)、綠膿假單胞桿菌(Pesudomonas pyocyaneum)、宋內志賀菌(Sh.sonnei)、福氏志賀氏菌(Sh.flexneri)、痢疾志賀氏菌(Sh.dysenteriae)、鮑氏志賀氏菌(Sh.boydii)、黏質沙雷氏菌(Serratia marcescens)、產堿普羅威登斯菌(Providencia Ewing)、副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus)、蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)、弗勞地檸檬酸桿菌(Citrobacterpneumonia)、變形桿菌(proteusbacillus vulgaris)、奇異變形桿菌(Proteus m irabilis)、摩爾根氏變形桿菌(Morganella morganii subsp.morganii)各1株。以上菌株均由石家莊市疾病預防控制中心提供。

1.1.2 儀器與試劑 PCR儀(美國PE公司);焦磷酸檢測儀PyroMark ID型(瑞典Biotage公司);GoTaqMasterMix(美國Promega公司);焦磷酸測序劑盒PyroGold Reagents、磁珠(瑞典 Biotage公司);DNA分子量標準Trans2K Plus、DNA分子量標準Trans2K(北京全式金生物技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 根據無乳鏈球菌 sip基因(GenBank:FJ752156.1)、停乳鏈球菌 isp基因(GenBank:CP002215.1)、沙門氏菌 stn 基因(GenBank:L16014.1)和金黃色葡萄球菌 clfa基因(GenBank:FJ808734.1)分別設計4對PCR擴增引物和4條焦磷酸測序引物，詳見表1。

表1 特異性引物Table 1 Specific primers

1.2.2 PCR模板的制備 各菌株復蘇后，于各自的選擇性液體培養基中37℃過夜振蕩培養。取培養后的菌液各1 mL，13000 r/min離心2 min后棄上清，加入500 μL的1×TE 溶液(pH 8.0)，吹打混勻后沸水浴10 min，冷卻至室溫，13000 r/min離心2 min后取上清，于－20℃保存，以備后續實驗作為模板使用。

1.2.3 PCR 擴增 PCR 反應體系(50 μL):2×Go Taq Master Mix 25 μL，上游引物和下游引物各10 pmol，模板1 μL，以無菌去離子水定容至50 μL。PCR反應參數:94℃預變性5 min;94℃變性1 min，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共30個循環;最后72℃延伸10 min。取反應產物5 μL于20 g/L瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。所有擴增重復3次。

1.2.4 焦磷酸單鏈模板的制備 ①將PCR產物30 μL轉移至96孔PCR板中，在產物中分別加入磁珠 3 μL和結合緩沖液(Binding Buffer，含 10 mmol/L 的 Tris-HCl，2 mol/L 的 NaCl，1 mmol/L的 EDTA，0.1%的 Tween-20，pH 7.6)47 μL，室溫震蕩混勻10 min;②打開真空泵，將真空預裝工具(Vacuum Prep Tool)在超純水中清洗30 s，然后轉移到96孔PCR板中，抓取磁珠，分別在70%乙醇、變性緩沖液(Denaturation Buffer;0.2 mol/L NaOH)、洗滌緩沖液(Washing Buffer，含 10 mmol/L 的 Tris-Acetate，pH 7.6)中清洗5 ～10 s，最后將其放入96孔測序板中，該板中預先加入0.3 μmol/L的測序引物和退火緩沖液(Annealing Buffer，含 20 mmol/L 的 Tris-Acetate，2 mmol/L 的Mg-Acetate，pH 7.6)共 45 μL，關閉真空泵，充分震蕩搖動以釋放磁珠。

1.2.5 焦磷酸測序 將放有樣品的96孔測序板于80℃恒溫箱中放置2 min，自然冷卻至室溫。將酶混合物、底物混合物和4類dNTP(dATPαS、dTTP、dCTP、dGTP)分別加入試劑艙固定位置。設定程序，將試劑艙和96孔測序板放入機箱中進行測序反應。所有測序重復3次。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增結果

利用1.2.1中設計的PCR擴增引物擴增各菌株的特異基因片段，經20 g/L瓊脂糖凝膠電泳后觀測，使用無乳鏈球菌sip基因特異性引物對108株無乳鏈球菌PCR擴增出的片段長度均約為142 bp，使用停乳鏈球菌isp基因特異性引物對100株停乳鏈球菌PCR擴增出的片段長度均約為64 bp，使用沙門氏菌stn基因特異性引物對136株沙門氏菌PCR擴增出的片段長度均約為107 bp，使用金黃色葡萄球菌clfa基因特異性引物對203株金黃色葡萄球菌PCR擴增出的片段長度均約為169 bp。3次重復性擴增實驗結果相同。其中部分無乳鏈球菌株的sip基因擴增結果如圖1A所示;部分停乳鏈球菌株的isp基因擴增結果如圖1B所示;部分沙門氏菌株的stn基因擴增結果如圖1C所示;部分金黃色葡萄球菌株的clfa基因擴增結果如圖1D所示。

圖1 4種基因片段的PCR擴增結果

為檢驗使用上述4種基因的特異性引物對其他菌株進行PCR擴增時是否會出現假陽性，分別使用上述4對特異性引物對1.1.1中所述所有菌株進行PCR擴增檢測。其中使用無乳鏈球菌sip基因特異性引物擴增的部分結果顯示，sip基因特異性引物只擴增出無乳鏈球菌的大小為142 bp的sip基因片段，而其他菌株未擴增出基因片段(如圖2A，部分的16株參照菌株);使用停乳鏈球菌isp基因特異性引物的擴增檢測的部分結果顯示，isp基因特異性引物只擴增出停乳鏈球菌的大小為64 bp的isp基因片段，而其他菌株未擴增出基因片段(如圖2B部分的16株參照菌株)。

圖2 部分參照菌株使用4種基因特異性引物擴增檢測結果Fig.2 Detection results of some reference strains by PCR with the four gene fragments specific primers

使用沙門氏菌stn基因特異性引物的擴增檢測的部分結果顯示，stn基因特異性引物只擴增出沙門氏菌的大小為107 bp的stn基因片段，而其他菌株未擴增出基因片段(如圖2C部分的16株參照菌株);使用金黃色葡萄球菌clfa基因特異性引物的擴增檢測的部分結果顯示，clfa基因特異性引物除擴增出金黃色葡萄球菌的大小為169 bp的clfa基因片段外，痢疾志賀氏菌和副溶血弧菌分別于DNA分子量標準Trans2K Plus的500 bp和250 bp指示條帶之間出現條帶，而其他菌株未擴增出條帶(如圖2D部分的16株參照菌株)。1.1.1中所述的且圖2中不包括的其他菌株的擴增檢測結果均未檢測出擴增條帶，且3次重復性擴增實驗結果相同，在此未一一列出。

2.2 焦磷酸測序結果

圖3 無乳鏈球菌sip基因擴增片段焦磷酸測序結果Fig.3 Pyrosequencing results of Streptococcus agalactiae sip gene fragment

圖4 停乳鏈球菌isp基因擴增片段焦磷酸測序結果Fig.4 Pyrosequencing results of S.dysgalactiae isp gene fragment

將2.1中無乳鏈球菌sip基因擴增片段、停乳鏈球菌isp基因擴增片段、沙門氏菌stn基因擴增片段、金黃色葡萄球菌clfa基因擴增片段按照1.2.4和1.2.5 所述方法進行焦磷酸測序。無乳鏈球菌sip基因擴增片段的焦磷酸測序結果為5'-GTTGCTGGTGTTTCTATTTTC-3'(如圖3)，與無乳鏈球菌sip基因序列(GenBank:FJ752156.1)比對結果為100%;停乳鏈球菌isp基因擴增片段的焦磷酸測序結果為5'-TACTGACATCACTGGAAGTGGTAAACG-3'(如圖4)，與停乳鏈球菌isp基因序列(GenBank:CP002215.1)比對結果為100%;沙門氏菌stn基因擴增片段的焦磷酸測序結果為5'-GCTGAAGGAGATTAAAGCG-3'(如圖5)，與沙門氏菌stn基因序列(GenBank:L16014.1)比對結果為100%;金黃色葡萄球菌clfa基因擴增片段的焦磷酸測序結果為5'-AAACCATAATTCAGTTT-3'(如圖6)，與金黃色葡萄球菌clfa基因序列(GenBank:FJ808734.1)比對結果為100%。

圖5 沙門氏菌stn基因擴增片段焦磷酸測序結果Fig.5 Pyrosequencing results of Sa.sp.stn gene fragment

圖6 金黃色葡萄球菌clfa基因擴增片段焦磷酸測序結果Fig.6 Pyrosequencing results of St.aureus clfa gene fragment

由于圖2D中以金黃色葡萄球菌clfa基因特異性引物進行參照菌株擴增檢測時，痢疾志賀氏菌和副溶血弧菌分別于DNA分子量標準Trans2K Plus的500 bp和250 bp指示條帶之間有基因片段擴增出，因此將此二項PCR產物進行焦磷酸測序。痢疾志賀氏菌擴增片段的焦磷酸測序結果無有序信號測出(如圖7)，測序失敗。副溶血弧菌擴增片段的焦磷酸測序結果同樣無有序信號測出(如圖8)，測序失敗。

圖7 基于clfa基因特異引物對痢疾志賀氏菌擴增出的條帶的焦磷酸測序結果Fig.7 Pyrograms obtained by pyrosequencing of the band，which was amplified from Sh.dysenteriae with the specific primers of clfa gene

圖8 基于clfa基因特異引物對副溶血弧菌擴增出的條帶的焦磷酸測序結果Fig.8 Pyrograms obtained by pyrosequencing of the band，which was amplified from V.parahaemolyticus with the specific primers of clfa gene

2.3 檢測結果統計分析

根據PCR擴增結果及焦磷酸測序結果進行統計(表2)。

表2 所有菌株的PCR及焦磷酸測序結果統計Table 2 The statistical analysis of PCR and pyrosequencing results of all reference strains

由表2可見，在所有參照菌中，以無乳鏈球菌sip基因特異引物進行PCR及焦磷酸測序，只有無乳鏈球菌(所有的108株)PCR成功擴增出條帶并得到正確的焦磷酸測序結果，而其他參照菌株PCR均無條帶擴出;以停乳鏈球菌isp基因特異引物進行PCR及焦磷酸測序，只有停乳鏈球菌(所有的100株)PCR成功擴增出條帶并得到正確的焦磷酸測序結果，而其他參照菌株PCR均無條帶擴出;以沙門氏菌stn基因特異引物進行PCR及焦磷酸測序，只有沙門氏菌(所有的136株)PCR成功擴增出條帶并得到正確的焦磷酸測序結果，而其他參照菌株PCR均無條帶擴出;以金黃色葡萄球菌clfa基因特異引物進行PCR及焦磷酸測序，只有無乳鏈球菌(所有的203株)PCR成功擴增出條帶并得到正確的焦磷酸測序結果，痢疾志賀氏菌以及副溶血弧菌PCR成功擴增出條帶但焦磷酸測序失敗，而其他參照菌株PCR均無條帶擴出。

因此可以得出結論:以無乳鏈球菌sip基因、停乳鏈球菌isp基因、沙門氏菌stn基因和金黃色葡萄球菌clfa基因的特異性引物進行PCR擴增并結合焦磷酸測序以快速檢測無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的方法是正確可行的。

3 討論

本研究建立了應用PCR-焦磷酸測序技術對奶牛乳房炎主要致病菌無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的檢驗方法，是國內外首次利用PCR-焦磷酸測序技術檢驗奶牛乳房炎的多種致病菌。使用該檢驗方法對大量目的菌株和參照菌株檢測驗證后，結果顯示該方法與微生物學檢驗方法和PCR檢驗方法相比，檢驗結果更加準確、并且縮短了檢驗時間［9］。

本研究在經過嚴格篩選和序列比對、分析后選取了具有菌種特異性的無乳鏈球菌sip基因、停乳鏈球菌isp基因、沙門氏菌stn基因和金黃色葡萄球菌clfa基因的核苷酸保守區段，并以此利用焦磷酸測序儀自帶的引物設計軟件(PyroMarkTM ID System、Biotage、Sweden)設計 PCR 擴增引物及焦磷酸測序引物。

使用設計好的4對引物對各自目的菌株進行PCR擴增，其中無乳鏈球菌108株、停乳鏈球菌100株、沙門氏菌136株、金黃色葡萄球菌203株，在優化了PCR擴增條件后均得到了滿意的擴增結果，將擴增產物進行焦磷酸測序，結果與原始序列完全一致。此結果說明上述選取的4種基因分別在各自的種內具有較好的保守性。使用上述4對引物對參照菌株進行PCR擴增(具體菌株見表2)，結果顯示無乳鏈球菌sip基因、停乳鏈球菌isp基因、沙門氏菌stn基因的引物PCR擴增結果全部陰性，僅有金黃色葡萄球菌clfa基因片段引物對痢疾志賀氏菌和副溶血弧菌擴增出假陽性條帶，對其PCR產物進行焦磷酸測序，結果顯示為測序失敗，沒有得到有意義的焦磷酸結果。此結果說明選取的4種基因在種間具有較好的特異性，僅存在于各自的菌種中。綜合對目的菌株和參照菌株的PCR擴增和焦磷酸測序結果說明，以無乳鏈球菌sip基因、停乳鏈球菌isp基因、沙門氏菌stn基因和金黃色葡萄球菌clfa基因的特異性引物進行PCR-焦磷酸測序以快速檢測無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的方法是正確可行的。由于該方法相對微生物學檢驗方法節省時間且結果可靠，與普通PCR相比可以進一步得到待測菌基因序列，結果準確性更高，因此該方法的建立對奶牛乳房炎致病菌的檢測提供了一種新的更加快速而準確的途徑［10］。

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