溫州蜜柑、椪柑采后酚類物質及抗氧化活性比較研究

沈 妍，葉興乾*

(浙江大學生物系統工程與食品科學學院，浙江 杭州 310058)

溫州蜜柑、椪柑采后酚類物質及抗氧化活性比較研究

沈 妍，葉興乾*

(浙江大學生物系統工程與食品科學學院，浙江 杭州 310058)

通過研究溫州蜜蜂柑、椪柑兩個常見柑橘品種貯藏期間類黃酮、酚酸類物質及抗氧化活性的變化規律，評價其采后的營養品質。結果表明：貯藏60d后溫州蜜柑較好地保持了抗壞血酸含量，而椪柑損失較大。類黃酮類物質較穩定，溫州蜜柑中黃烷酮含量貯藏后有所增加，椪柑中則呈緩慢下降趨勢，2種柑橘中酚酸類物質貯藏后都有所增加?？偡雍吭谫A藏前期呈下降趨勢，貯藏后期溫州蜜柑中總酚含量增加而在椪柑中進一步下降?？寡趸芰εc抗壞血酸的變化趨勢類似。與椪柑相比，貯藏期間溫州蜜柑能更好地保持果實的營養品質及酚類物質，從而保持較高的抗氧化活性。

柑橘；貯藏；類黃酮；酚酸；抗氧化能力

柑橘是世界上最重要的農產品之一，品種豐富且產量高，是人們膳食的重要組成部分。柑橘果實富含VC、各種氨基酸、有機酸等營養成分，同時也是一些生理活性成分的重要來源，如類黃酮、酚酸等酚類物質、檸檬苦素、類胡蘿卜素等。近年來的眾多研究[1-2]表明柑橘中的酚類物質具有預防慢性疾病、抗癌、抗炎、抗氧化等多種生理功能，因此也越來越受人們關注。但國內外在柑橘果實采后酚類物質和抗氧化活性變化方面的研究很少[3-4]，特別是對具體的酚類物質的研究。本實驗以2種常見寬皮柑橘為材料，研究其采后酚類物質及抗氧化活性的變化，以探索柑橘采后貯藏過程中功能成分的變化規律，旨在為柑橘果實品質及其貯藏加工研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

溫州蜜柑、椪柑，由浙江黃巖柑橘研究所提供，正常成熟度采收。

柚皮蕓香苷、橙皮苷、咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、芥子酸、福林酚試劑、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、三吡啶三吖嗪(TPTZ) 美國Sigma公司；液相色譜用甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

KA-1000型離心機 上海安亭科學儀器廠；RE-52AA旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；Waters 2695高效液相色譜(配有Waters 2998二極管陳列檢測器) 美國Waters公司；UV-2550紫外-可見光分光光度計 日本島津公司；Agilent SB-C18反相色譜柱(250nm×4.6mm，5μm) 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

柑橘采收后不經處理，選取大小均勻、無病害損傷的果實，經自來水清洗晾干后，裝入紙箱于10℃庫房貯藏2個月。每15d測定一次指標，每次隨機取15個果實，做3個重復，果實去皮榨汁后用4層紗布過濾用于測定。

1.3.2 果實品質指標的測定

可溶性固形物含量(SSC)：采用阿貝折光儀測定；可滴定酸(TA)：采用NaOH滴定法測定。

1.3.3 抗壞血酸含量的測定

參照文獻Xu Guihua等[5]的方法，1.000g果汁加入6mL 0.1g/100mL的草酸混合提取3min，于4000r/min離心10min，殘渣再提取，上清液混合定容于10mL容量瓶，立即通過0.45μm的水膜后注入液相色譜。使用C18反相色譜柱(250mm×6mm，5μm)，以0.1g/100mL草酸為流動相，流速為1.0mL/min，柱溫為25℃，作抗壞血酸標準曲線，在243nm波長處進行外標法定量。

1.3.4 烷酮糖苷含量的測定

參照文獻Xu Guihua等[5]的方法，1.000g果汁加入6mL 80%甲醇-甲基亞砜(1:1，V/V)混合液混合均勻，提取10min，4000r/min離心20min，殘渣再提取，上清液混合定容于10mL容量瓶。取10μL經0.22μm濾膜過濾的提取液注入高效液相色譜系統，使用C18反相色譜柱，以4%乙酸-甲醇(37:63，V/V)作為動相，流速為1.0mL/min，柱溫為30℃，樣品洗脫時間為15min，檢測波長為283nm，配制柚皮蕓香苷、橙皮苷混合標準溶液，制得標準曲線，外標法定量。實驗結果表明，柚皮蕓香苷和橙皮苷標樣質量濃度分別在25～130μ g/mL和200～1000μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好(R2＞0.999)，測定可重復性、回收率、標準偏差結果良好。

1.3.5 酸含量的測定

酚酸的提取參照Nardini等[6]的方法，取2.000g果汁加3mL蒸餾水，加入5mL 4mol/L的NaOH溶液(含1g/100mL抗壞血酸和10mmol/L EDTA)氮氣保護下堿水解4h。用6mol/L鹽酸調pH值至1～2，4000r/min離心10min，上清液用乙酸乙酯-乙醚(1:1，V/V)萃取3次(與上清液體積比1:1)，合并萃取液，用無水硫酸鈉干燥后濾紙過濾，于30℃旋轉蒸發濃縮至干，用甲醇定容至10mL。過0.22μm有機濾膜后進樣，色譜柱為C18反相色譜柱，以4%乙酸-甲醇(80:20，V/V)作為流動相，流速為1mL/min，柱溫為3 0℃，檢測波長為320nm，樣品洗脫35min[7]。配制咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、芥子酸混合標準溶液，作標準曲線，外標法定量。結果表明，4種酚酸分別在0.2～1.0、2～10、5～25、0.2～1.0μg/mL范圍內標樣質量濃度與峰面積線性關系良好(R2＞0.999)，測定可重復性、回收率、標準偏差結果良好。

1.3.6 總酚含量測定

參照Singleton等[8]的方法(Folin-酚法)，1.000g果汁加入6mL 80%的甲醇，4000r/min離心20min，殘渣再提取，上清液混合定容于10mL容量瓶。25mL容量瓶中加入9mL蒸餾水，加入1mL樣品提取液，混勻后加0.5mL Folin-酚試劑，并不斷振搖使之迅速反應。放置5min后加入5mL 5g/100mL的Na2CO3溶液，邊加邊用蒸餾水振搖并定容至25mL。60min后于750nm波長處測定吸光度，以二次蒸餾水為空白。以沒食子酸作標準曲線，計算沒食子酸當量總酚含量 (gallic acid equivalent content，GAE)。

1.3.7 DPPH自由基清除率的測定[9]

樣品提取同1.3.5節，0.2mL提取液加入到2.8mL 0.1mmol/L DPPH試劑中，避光反應30min，于517nm波長處測吸光度，空白為0.2mL 80%甲醇溶液加入到2.8mL DPPH試劑中的吸光度。

式中：A1為空白吸光度；A2為樣品吸光度。

1.3.8 FRAP鐵離子還原能力的測度

參照Benzie等[10]的方法，樣品提取同總酚，4.9mL FRAP試劑(由pH3.6的0.1mol/L醋酸緩沖液、10mmol/L TPTZ、20mmol/L三氯化鐵溶液以體積比10:1:1混合配制)與0.1mL提取液混勻后于37℃反應10min后在593nm波長處測吸光度，空白為0.1mL 80%甲醇溶液。以抗壞血酸作標準曲線，計算抗壞血酸當量抗氧化能力(AEAC)。

1.4 數據處理

使用Origin 8.0對數據進行圖表制作，SPSS軟件對數據顯著性進行分析(α＝0.05)。

2 結果與分析

2.1 溫州蜜柑和椪柑采后基本品質指標變化

柑橘屬于非躍變型果實，采后營養成分不會發生顯著的變化，果實的糖酸含量是影響果實風味的主要因素。如表1所示，溫州蜜柑和椪柑貯藏期間TSS都呈略微上升趨勢，而TA貯藏后含量下降，其中椪柑TA下降較顯著，pH值則反映了TA的變化趨勢。果實采后有機酸會作為呼吸作用底物被消耗，而淀粉等多糖轉化為可溶性碳水化合物，不溶性原果膠轉化為可溶性果膠等溶于果汁，使SSC上升[11]。隨著貯藏期的延長，SSC含量的增加及TA的下降會提高果實糖酸比，改善果實風味，但下降過快則會使果實風味不足?？梢?，經貯藏椪柑果實的可滴定酸下降過快，其風味損失較快，而溫州蜜柑變化較小。

表1 溫州蜜柑和椪柑貯藏期品質指標變化Table 1 Change in quality parameters of satsuma mandarin and ponkan fruits during storage

2.2 溫州蜜柑和椪柑采后抗壞血酸含量變化

圖1 溫州蜜柑和椪柑貯藏期間抗壞血酸含量變化Fig.1 Change in ascorbic acid content of satsuma mandarin and ponkan fruits during storage

抗壞血酸是柑橘果實的主要營養成分，具有良好的抗氧化作用，因此也是評價果實營養品質的重要指標。眾多研究表明隨著果實的衰老，抗壞血酸也會逐漸損失。由圖1可知，選取的2個品種中溫州蜜柑的抗壞血酸含量更高，貯藏前2個品種中含量分別為(346.36±3.45)mg/kg和(289.20±7.45)mg/kg。在貯藏過程中兩個品種抗壞血酸含量變化差異較大。溫州蜜柑在貯藏過程中抗壞血酸變化較平緩，貯藏60d后有略微地下降。而椪柑在貯藏15d后抗壞血酸含量顯著下降，貯藏時間越長損失越大?？梢姉崭坦麑嵸A藏后營養成分損失較顯著，而溫州蜜柑變化不大，這與果實的耐貯性和果皮組織等有關。

2.3 溫州蜜柑和椪柑采后黃烷酮糖苷含量變化

柑橘中的類黃酮主要以黃烷酮糖苷形式存在，主要包括柚皮蕓香苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷等，另外還有川橙皮素、橘皮素等多甲氧基黃酮。黃酮類物質在人和動物體具有抗腫瘤、抗菌、抗炎、降低毛細血管脆性、抗過敏、抑制血小板凝集等多方面的藥理作用。柑橘中黃烷酮糖苷含量豐富，以橙皮苷為主，果汁中橙皮苷含量高達200～500mg/L，但品種間差異較大[5]。表2所示為溫州蜜柑和椪柑在貯藏過程中兩種黃烷酮糖苷含量的變化?？梢姵绕ぼ帐?種柑橘的主要黃酮類物質，其含量顯著高于柚皮蕓香苷。椪柑中的橙皮苷含量遠高于溫州蜜柑，但其柚皮蕓香苷含量僅為溫州蜜柑的一半左右。經貯藏，椪柑中的橙皮苷和柚皮蕓香苷含量都呈逐漸下降趨勢，但變化較平緩。溫州蜜柑中的黃烷酮糖苷則在貯藏過程中有上升過程，在30d時兩種物質含量都顯著增加，之后顯著下降，貯藏60d后又呈上升趨勢。研究表明類黃酮物質在果蔬采后可能會繼續合成，貯藏后含量增加，其含量的下降則可能由果實衰老造成，同時果實貯藏后期失水也會對其含量產生影響[12-13]。

表2 溫州蜜柑和椪柑貯藏期間黃烷酮糖苷含量變化Table 2 Change in flavanone content of satsuma mandarin and ponkan fruits during storage

2.4 溫州蜜柑和椪柑采后酚酸含量變化

柑橘眾多品種中酚酸類物質主要為肉桂酸型酚酸，包括香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸。近年來發現酚酸具有抗氧化、抗炎癥、抗突變、抗心血管疾病等多種生理功能[14-15]。表3所示為溫州蜜柑和椪柑貯藏期間酚酸含量的變化?？梢姲⑽核崾?種柑橘中含量最豐富的酚酸類物質，2個品種阿魏酸含量相當，而咖啡酸、對香豆酸、芥子酸的含量不同，溫州蜜柑中的對香豆酸＞咖啡酸＞芥子酸，而椪柑中咖啡酸＞芥子酸＞對香豆酸。貯藏后2個品種中4種酚酸含量都有所增加，除了芥子酸外都有顯著變化。溫州蜜柑中阿魏酸在貯藏30d前含量顯著增加之后略有下降，椪柑中的阿魏酸則是在貯藏45d顯著增加。溫州蜜柑中的咖啡酸含量貯藏15d前顯著增加，之后變化較平緩，而椪柑中的咖啡酸含量在貯藏前期顯著下降，貯藏后期顯著增加。溫州蜜柑中對香豆酸含量在貯藏30d前顯著降低，之后其含量顯著增加，椪柑則是前期變化不顯著，貯藏60d后含量顯著增加。貯藏過程中2種柑橘中芥子酸的變化都不顯著，貯藏后略有增加，其中椪柑上升幅度更大?？梢?，貯藏后2個品種柑橘的酚酸含量都有所增加，其中椪柑的增加幅度更大。果蔬中的酚酸類物質較穩定，在貯藏期間仍能保持其含量并有所增加，但其機理還有待研究。

表3 溫州蜜柑和椪柑貯藏期酚酸含量的變化Table 3 Change of phenolic acids in satsuma mandarin and ponkan fruits during storage

2.5 溫州蜜柑和椪柑采后總酚含量變化

圖2 溫州蜜柑和椪柑貯藏期間總酚含量變化Fig.2 Change in total content of phenolic compounds in satsuma mandarin and ponkan fruits during storage

柑橘的總酚含量和抗壞血酸、花色素、類黃酮、酚酸等物質有關。圖2為溫州蜜柑和椪柑采后總酚含量的變化?？梢?種柑橘在貯藏前45d，總酚含量都呈略微下降趨勢，且含量相當，但在貯藏60d后，溫州蜜柑的總酚含量顯著增加，椪柑則進一步下降。這可能是抗壞血酸、類黃酮、酚酸類物質變化的綜合結果，黃酮類物質和酚酸類物質貯藏后含量的增加導致了溫州蜜柑總酚含量的增加，而由于椪柑貯藏后期抗壞血酸含量的大幅下降其總酚含量繼續下降。

2.6 溫州蜜柑和椪柑采后抗氧化能力變化

圖3 溫州蜜柑和椪柑貯藏期間DPPH自由基清除率(A)和FRAP值(B)的變化Fig.3 Change in DPPH radical scavenging capacity and FRAP value of satsuma mandarin and ponkan fruits during storage

由圖3可知，2種方法(FRAP法和DPPH法)測得的抗氧化能力變化趨勢類似。貯藏期間溫州蜜柑的抗氧化能力變化較平緩，貯藏前期略微上升，后期下降。而椪柑經貯藏后，抗氧化能力顯著下降，這與抗壞血酸含量的變化趨勢較類似。柑橘中VC、花色素、類黃酮、酚酸等物質的含量都會影響其抗氧化能力，柑橘含有豐富的抗壞血酸，因此抗壞血酸可能是影響其抗氧化能力的主要因素。

3 結 論

柑橘貯藏期間營養成分損失較緩慢，但不同品種差異較顯著。經過長期的貯藏，溫州蜜柑能較好地保持果實的營養品質及酚類物質，從而保持其較高的抗氧化活性。椪柑貯藏后營養品質損失較大，如可滴定酸與抗壞血酸，從而顯著降低了其抗氧化活性。酚類物質在貯藏過程中較穩定，貯藏后溫州蜜柑中的黃酮類物質有所增加，椪柑中則緩慢下降，酚酸類物質在2種柑橘采后貯藏過程中都有所增加，這可能與酚類物質合成的一些酶活性有關?？寡趸芰εc抗壞血酸變化趨勢類似，同時又與酚類物質的變化相關?？偟膩碚f，溫州蜜柑經長期貯藏后不會影響其酚類物質和抗氧化活性，具有較好的功能營養品質及貯藏加工特性。但目前柑橘采后酚類物質及抗氧化活性變化還缺乏系統的研究，其變化機理也有待進一步明確。

[1] VINSON J A, LIANG Xiquan, PROCH J, et al. Polyphenol antioxidants in citrus juices:in vitroandin vivostudies relevant to heart disease[J]. Advances in Experimental Medicine and Biology, 2002, 505: 113-122.

[2] 葉興乾, 徐貴華, 方忠祥, 等. 柑橘屬類黃酮及其生理活性[J]. 中國食品學報, 2008, 8(5): 1-6.

[3] RAPISARDA P, LO BIANCO M, PANNUZZO P, et al. Effect of cold storage on vitamin C, phenolics and antioxidant activity of five orange genotypes [Citrus sinensis(L.) Osbeck][J]. Postharvest Biology and Technology, 2008, 49(3): 348-354.

[4] KLIMCZAK I, MALECKA M, SZLACHTA M, et al. Effect of storage on the content of polyphenols, vitamin C and the antioxidant activity of orange juices[J]. Journal of Food Composition and Analysis, 2007, 20(3/4): 313-322.

[5] XU Guihua, LIU Donghong, CHEN Jianchu, et al. Juice components and antioxidant capacity of citrus varieties cultivated in China[J]. Food Chemistry, 2008, 106(2): 545-551.

[6] NARDINI M, CIRILLO E, NATELLA F, et al. Detection of bound phenolic acids: prevention by ascorbic acid and ethylenediaminetetraacetic acid of degradation of phenolic acids during alkaline hydrolysis[J]. Food Chemistry, 2002, 79(1): 119-124.

[7] SUBBA RAO M V, MURALIKRISHNA G. Evaluation of the antioxidant properties of free and bound phenolic acids from native and malted finger millet (Ragi,Eleusine coracanaIndaf-15)[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2002, 50(4): 889-892.

[8] SINGLETON V L, ORTHOFER R, LAMUELA-RAVENTOS R M.Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent[J]. Methods in Enzymology, 1999,299: 152-178.

[9] GORINSTEIN S, HARUENKIT R, PARK Y S, et al. Bioactive compounds and antioxidant potential in fresh and dried Jaffa?sweeties, a new kind of citrus fruit[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture,2004, 84(12): 1459-1463.

[10] BENZIE I F, STRAIN J J. The ferric reducing ability of plasma (FRAP)as a measure of “antioxidant power”: the FRAP assay[J]. Analytical Biochemistry, 1996, 239(1): 70-76.

[11] 王大平. 熱處理對臍橙貯藏品質的影響[J]. 北方園藝, 2008(10): 197-199.

[12] 丁帆, 劉寶貞, 王壯, 等. 貯藏溫度對柑橘果肉中檸檬苦素和柚皮苷含量變化的影響[J]. 華中農業大學學報, 2010, 29(2): 221-226.

[13] 黃仁華, 陸云梅, 夏仁學. 采前水楊酸處理對紅肉臍橙貯藏期抗氧化活性的影響[J]. 食品科學, 2009, 30(20): 455-458.

[14] SILVA F A M, BORGE S F, GUIMARES C, et al. Phenolic acids and derivatives: studies on the relationship among structure, radical scavenging activity, and physicochemical parameters[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2000, 48(6): 2122-2126.

[15] RAO C V, DESAI D, SIMI B, et al. Inhibitory effect of caffeic acid esters on azoxymethane-induced biochemical changes and aberrant crypt foci formation in rat colon[J]. Cancer Research, 1993, 53(18): 4182-4188.

Comparison of Phenolic Compounds and Antioxidant Activity in Satsuma Mandarin and Ponkan during Storage

SHEN Yan，YE Xing-qian*
(School of Biosystems Engineering and Food Science, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China)

The regularity of changes in phenolic compounds (flavonoids and phenolic acids) and antioxidant activity of citrus fruits from two common varieties, satsuma mandarin and ponkan during storage were determined for the evaluation of postharvest functional quality. The results indicated that ascorbic acid content revealed a drastic decrease in ponkan fruits during storage for 60 days while satsuma mandarin maintained a high level. Phenolic compounds in both varieties were stable. Flavanone content increased after storage in satsuma mandarin but decreased in ponkan. Phenolic acids increased in both varieties. The content of total phenolic compounds gradually decreased during the early storage period, and increased in satsuma mandarin in the end of storage. Antioxidant activity and ascorbic acid content showed similar change trends. Satsuma mandarin maintained better fruit quality and higher content of phenolic compounds as well as antioxidant activity when compared with ponkan.

citrus；storage；flavonoids；phenolic acids；antioxidant activity

TS205

A

1002-6630(2012)15-0038-05

2011-07-06

“十一五”國家科技支撐計劃項目(2006BAD27B06)

沈妍(1986—)，女，博士研究生，研究方向為柑橘功能性成分研究。E-mail：04spkxsy@zju.edu.cn

*通信作者：葉興乾(1962—)，男，教授，博士，研究方向為果蔬加工和食品工藝。E-mail：psu@zju.edu.cn