四川香腸中產蛋白酶和脂肪酶霉菌的分離與鑒定

楊 勇，程 燕*，廖定容，帥 謹

(四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014)

四川香腸中產蛋白酶和脂肪酶霉菌的分離與鑒定

楊 勇，程 燕*，廖定容，帥 謹

(四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014)

從四川自然發酵香腸表面分離得到121株霉菌菌株，分屬曲霉、青霉和毛霉，以蛋白酶、脂肪酶活性作為篩選指標，經初篩、復篩，得到一株產蛋白酶、脂肪酶活性強的菌株P2。經形態觀察以及菌株的分子生物學鑒定，該菌株鑒定為產黃青霉。通過對該菌株進行毒理學實驗，表明各實驗組小白鼠行為體征、血液指標、生化指標以及臟器的顏色、形狀、大小均與空白對照組之間無顯著差異，可初步判定該菌株是安全無毒的。

四川香腸；霉菌；蛋白酶；脂肪酶；分離；鑒定

霉菌在食品加工工業中用途十分廣泛，許多釀造發酵食品、食品原料的制造，如豆腐乳、豆豉、醬、醬油、檸檬酸等都是在霉菌的參與下生產加工出來的。絕大多數霉菌能把加工原料中的淀粉、糖類等碳水化合物、蛋白質等含氮化合物及其他種類的化合物進行轉化，制造出多種多樣的食品、調味品及食品添加劑。霉菌在發酵肉制品中的應用主要集中于歐洲南部，比如意大利、西班牙、法國、匈牙利和德國的南部，主要的發酵肉制品類型有火腿、熏肉薄片、風干脖肉、杯形香腸、干腌香腸。

霉菌發酵肉制品是由霉菌的酶(蛋白酶、脂酶)系，在肉制品表面形成一層“保護膜”，充分隔氧，防止制品酸敗、褪色，有利于產品的干燥，形成特征的表面外觀，同時分解蛋白質、脂肪和乳酸產生特殊香味[1-2]。關于霉菌對香腸風味影響的研究文獻有很多[3-9]，主要是兩方面：一是霉菌產生的脂肪酶分解脂肪，提高游離氨基酸的含量，對產品的香味和風味起重要作用；二是霉菌的蛋白酶對蛋白質進行水解，產生特殊的感官特征。目前國外已經篩選出了7種產黃青霉和2種納地青霉用于工業化生產；德國將白地青霉和婁地青霉用于肉制品發酵已取得了成功。

傳統發酵肉制品生產，其霉菌直接來自于環境并非人為接種的，常檢測出有霉菌毒素的存在[10-12]，因此用于發酵肉制品的霉菌應經過嚴格的篩選，確定其不產生霉菌毒素才能保證產品的安全性。霉菌作為肉品發酵劑，必須具備有不產毒素和無潛在的病原性威脅的特點，同時應具有良好均衡的蛋白質和脂肪降解活性，菌絲可以使產品表面致密堅固，顏色為灰白、黃色或烏黑。

四川香腸是國內傳統腌臘制品中的典型代表之一，因其香氣濃郁、滋味鮮美、風味獨特而深受廣大消費者的喜愛，在四川特產食品中，占有較高的地位并享有很好的聲譽。其中含有豐富的有益微生物，是篩選優良發酵劑的重要微生物資源，具有很高的研究價值和開發潛力。本研究根據肉用發酵劑的篩選原則，以菌株產蛋白酶和脂肪酶能力為指標，以傳統四川香腸為材料，以毒理學實驗為依據，從中分離出安全的產蛋白酶和脂肪酶的霉菌菌株，同時對其進行形態和分子生物學鑒定，以期為發酵肉制品生產霉菌發酵劑的篩選與開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種與動物

所有菌株均從傳統四川香腸中分離，香腸為四川農業大學食品學院肉品加工室的自制產品。

普通級昆明種小鼠，由成都達碩實驗動物技術公司提供，合格證是：SCXK(川)2008-24，小鼠體質量均為18～22g。

1.2 培養基

察氏培養基：硝酸鈉3g、磷酸氫二鉀1g、硫酸鎂0.5g、氯化鉀0.5g、硫酸鐵0.01g、蔗糖30g，蒸餾水1000mL，瓊脂20g，121℃滅菌20min，供菌株分離用。

PDA培養基：葡萄糖20g、瓊脂15g，200g馬鈴薯去皮后切丁，加入1L自來水煮沸30min后過濾，濾液以蒸餾水補滿1L，121℃滅菌15min。

孟加拉紅培養基：蛋白胨5g、葡萄糖10g、磷酸二氫鉀1g、硫酸鎂0.5g，1/3000孟加拉紅100mL，瓊脂20g，補水至1000mL，115℃滅菌30min。

蛋白酶檢測培養基：以PDA為基礎培養基，添加100g脫脂奶粉，115℃滅菌20min，其他條件不變。

脂肪酶檢測培養基[13](三丁酸甘油酯瓊脂)：將PDA培養基在121℃滅菌15min，冷卻至80℃時，加入1%三丁酸甘油酯。

1.3 儀器與設備

DHP-9162恒溫培養箱 上海一恒科技有限公司；DSX-280B手提式高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安公司；SWCJ-1F潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；Sorvall離心機 美國科俊儀器有限醫療器械廠；MyCycler PCR儀、PowerPac Basic電泳儀、水平電泳槽、凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司；全自動生化分析儀 意大利AMS公司；微量移液器 美國Thermo Finnpipette公司。

1.4 方法

1.4.1 菌種的分離純化

以無菌操作剪取不同晾掛發酵期的香腸為樣品，用無菌生理鹽水制成一定濃度的菌懸液，分別于察氏培養基、PDA培養基、孟加拉紅培養上涂布，培養5d挑取單個菌落進一步分離純化。

1.4.2 菌株初篩實驗

將所分離、純化的菌株，接種于蛋白酶活性篩選培養基和脂肪酶活性培養基中。25℃恒溫培養5d，分別測定每皿中透明圈直徑和菌落直徑，以每皿中3個菌落的平均值記為該菌株的測定結果，計算HE值(HE值=透明圈直徑/菌落直徑)。選擇HE值較大的菌株，進一步做復篩實驗。

1.4.3 菌株復篩實驗

1.4.3.1 粗酶液的制備

將經過初篩后HE值較高的菌株，分別接種于PDA液體培養基中，置于旋轉搖床上160r/min，25℃培養3d，取若干滅菌玻璃珠于三角瓶內，振搖，破碎菌絲，40℃水浴浸提1h，然后過濾，所得濾液即粗酶液，用于酶活性的測定。

1.4.3.2 蛋白酶活力測定

采用Folin-酚法[14]測定蛋白酶活力。酶活力單位定義為40℃、pH7.0條件下，1min內水解酪蛋白產生1μg酪氨酸所需的酶量為1個蛋白酶活力單位以U表示。

1.4.3.3 脂肪酶活力測定

以橄欖油為底物，采用NaOH滴定法[15]。酶活力單位定義為40℃、pH7.5條件下，以每分鐘產生1μmol脂肪酸所需的酶量定義為1酶活力單位，以U表示。

1.4.4 霉菌的鑒定

1.4.4.1 菌落形態

觀察分離培養基平板上菌落的形態，并記錄結果。

1.4.4.2 菌株形態

將分離得到的菌株用乳酸苯酚液固定制成載片標本，在高倍顯微鏡下觀察。

1.4.4.3 菌株的分子生物學鑒定[16]

DNA的提取采用試劑盒法(Omega真菌DNA提取試劑盒)。PCR擴增反應，以提取的菌株DNA為模板，ITS1(5＇-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3＇)、ITS4 (5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇)為引物，采用常規方法進行。將序列在GenBank中已有的ITS序列進行相似性比較分析。選取與供試菌株相似度高的序列，構建系統進化樹，更直觀的反映菌株間的親緣關系。

1.4.5 霉菌的毒理學實驗[17]

1.4.5.1 受試物

受試物為菌株的發酵液。將篩選出的菌株以土豆液體培養基為原料，在25℃、160r/min搖床培養48h的發酵液，發酵液直接飼喂昆明種小鼠。

1.4.5.2 急性毒理實驗

按照GB 15193.3—2003《急性毒性試驗》方法。健康的昆明種小鼠40只(雌雄各半)，按照隨機分組原則分為2組，每組20只，雌雄各半。實驗組按0.4mL/20g(以體質量計)，分兩次(間隔4h)將孢子懸液經口灌胃小白鼠；空白對照組給予相同劑量無菌土豆培養液。實驗前禁食過夜，禁食期間正常給水。灌胃2h后恢復正常飲食。實驗期限為15d。每天觀察記錄小白鼠飲水、進食、活動及死亡情況。

1.4.5.3 30d喂養實驗

按照 GB 15193.13—2003《30天和90天喂養試驗》方法。健康昆明小鼠80只(雌雄各半)，按照隨機分組原則分為4組，青霉P2發酵液各設為2.5、5.0、10.0g/kg(以體質量計)3個劑量組，并設蒸餾水為空白對照組。

2 結果與分析

2.1 霉菌的分離、純化和初步鑒定結果

從四川香腸中分離出霉菌菌株121株，分離出的菌株主要為青霉(Penicillium)、毛霉(Mucor)和曲霉(Aspergillus)。Sutic等[18]從356條美國鄉村火腿中分離到403株青霉，121株式曲霉。Comi等[19]從伊比亞火腿表面分離到占優勢的青霉、曲霉、毛霉、散囊菌和鐮刀霉，其中青霉、曲霉和散囊菌共占了97%。陳士怡等[20]從金華火腿表面分離出226株青霉、159株曲霉。蔣云升等[21]從80條不同發酵期如皋火腿上分離出152株霉菌菌株，分屬于曲霉、青霉、毛霉。本研究的實驗結果與上述報道基本一致，說明霉菌是自然發酵肉制品中的重要微生物。

2.2 菌株初篩實驗結果

經過初步鑒定的各屬菌株經培養后，挑選生長速度快、孢子致密、透明圈明顯的菌株進行蛋白酶和脂肪酶HE值的測定，并選出同時具有較高蛋白酶HE值和脂肪酶HE值的8株，將其HE值繪制成圖，見圖1。

圖1 霉菌菌株的蛋白酶和脂肪酶HE值Fig.1 HE values of protease and lipase of eight strains

由圖1可知，蛋白酶HE值從高到低依次為：P13、P2、P1、P35、P41、A31、A4、M12；脂肪酶 H E值從高到低依次為：P2、P41、P13、P35、A4、P1、A31、M12。

2.3 菌株復篩實驗結果

對初篩結果HE值較高的8株菌種進行酪氨酸產量和脂肪酶活力測定，結果見表1。

表1 受試菌酪氨酸產量和脂肪酶活力(±s，n=3)Table 1 Protease and lipase activities of tested strains (±s，n=3)

表1 受試菌酪氨酸產量和脂肪酶活力(±s，n=3)Table 1 Protease and lipase activities of tested strains (±s，n=3)

編號 酪氨酸產量/(μg/mL) 脂肪酶活力/(U/mL)P1 27.11±0.06 4.35±0.11 P2 30.25±0.19 5.05±0.17 A4 20.83±0.09 4.33±0.13 M12 24.36±0.13 3.66±0.09 P13 49.46±0.31 4.41±0.06 A31 23.97±0.23 4.55±0.07 P35 29.80±0.31 4.39±0.06 P41 23.58±0.12 4.77±0.14

由表1可知，菌落的酪氨酸產量從高到低依次是：P13、P2、P35、P1、M12、A31、P41、A4；菌落脂肪酶活力從高到低依次是：P2、P41、A31、P13、P35、P1、A4、M12?？煽闯鼍昵嗝筆2的蛋白酶和脂肪酶活性最高。

霉菌產生的脂肪酶分解脂肪提高游離氨基酸的含量，對產品的香味和風味起重要作用[22]，霉菌的水解蛋白能力與感官特征有一定的關系[23-24]，因此在許多研究中，脂肪酶和蛋白酶活性是第一篩選標準。Rojas等[25]從火腿中分離出具有較高蛋白水解能力的222株產黃青霉，它們降解火腿中的蛋白質，生產大量游離氨基酸，使火腿呈香。Ockerman等[26]從西班牙火腿中分離出脂肪酶活性較強的5株青霉，并對其進行脂肪酶活力測試。蔣云升等[21]從如皋火腿腸中分離出152株菌株，其中青霉屬具有較高的蛋白酶和脂肪酶活性。本研究中蛋白酶和脂肪酶的測試結果也充分說明從四川發酵香腸中分離出的青霉菌具有蛋白酶和脂肪酶活性，同時P2菌株具有較高的蛋白酶和脂肪酶活力。

2.4 菌種的鑒定

2.4.1 形態特征

菌落形態特征：在PDA培養基25℃培養5d后生長旺盛，生長至直徑21～25mm。菌落初生為白色，隨著不斷生長變為青綠色，邊緣菌絲體白色，菌落成圓形，質地絨狀，邊緣整齊，菌落反面呈淡黃色至黃色。

顯微鏡觀察結果：子實體為帚狀，其帚狀枝有單束的小梗，分生孢子小梗有分枝，產生單輪帚狀枝。孢子成串或鏈狀，單個孢子為球形，非常光滑。依據文獻[15]資料，初步鑒定為半知菌門，絲孢綱，叢梗孢科，青霉屬(Penicillium)。

2.4.2 分子生物方法鑒定結果

以P2菌株的總DNA為模板，采用通用引物進行擴增，經瓊脂糖電泳檢測，出現唯一條帶，大約為540bp的特異性擴增產物，如圖2所示。

圖2 P2的18S rDNA的PCR產物電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR-amplified 18S rDNA from P2 strain

經DNA序列分析，菌株P2的18S rDNA序列長度為552bp，該序列已在GenBank上注冊(JQ011376)。將測得的序列與數據庫中已注冊的18S rDNA序列進行B L A S T，并建立系統發育樹，如圖3所示。P2和Penicillium chrysogenumstrain F2 (HQ380757)的親緣關系最近，同源性達到9 8%，可歸為一群。

圖3 菌株P2序列進行BLAST的系統發育進化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 18S rDNA sequence

2.5 毒理學實驗結果

在30d喂養期間，對照組和喂養組均未出現小白鼠死亡現象，進食、飲水和行為活動均正常，未觀察到任何異常行為和體征。說明P2菌株發酵液對小白鼠生理功能無明顯損害性。

2.5.1 急性毒理學實驗結果

在實驗期間各實驗組小白鼠飲食和活動正常，生長發育良好，體質量增加，未見有任何明顯的中毒表現，也無死亡。小白鼠喂養15d后解剖，肉眼觀察其心、肝、脾、肺、腎、腸等臟器，與空白對照組相比，皆未發現病變和差異。這表明菌株發酵液的飼喂劑量達10.0g/kg體質量時不會引起小白鼠的死亡。按急性毒性劑量評價分級標準屬無毒級物質[27]。

2.5.2 30d喂養實驗結果

2.5.2.1 小白鼠30d的喂養進食量和食物利用率的影響

表2 P2菌株發酵液對小鼠食物利用率的影響Table 2 Effect of fermentation broth of P2 strain on mouse body weight, feed intake and feed conversion efficiency

由表2可知，P2發酵液各組與空白對照組之間無統計學的差異(P＞0.05)，可見P2發酵液喂養小鼠后，對其體質量進食量和食物利用率無明顯影響。隨著劑量的增加，食物的利用率略微增加，這說明P2發酵液在高劑量下，可能對小鼠有促進消化的功效。

2.5.2.2 小鼠血液學指標分析

由表3可知，各飼喂劑量組的小鼠紅細胞、白細胞、血小板以及血紅蛋白數結果與空白對照組之間無顯著差異(P＞0.05)。即P2發酵液對小鼠的血常規指標無明顯影響。

表3 P2發酵液對小鼠血液指標的影響(±s，n=3)Table 3 Effect of fermentation broth of P2 strain on mouse blood indexes (±s，n=3)

表3 P2發酵液對小鼠血液指標的影響(±s，n=3)Table 3 Effect of fermentation broth of P2 strain on mouse blood indexes (±s，n=3)

注：同列肩標字母不同表示差異顯著(P＜0.05)。下同。

性別 組別 紅細胞/(1012個/L) 白細胞/(109個/L) 血紅蛋白含量/(g/L) 血小板含量/(109/L)2.5g/kg 9.41±0.38a 7.71±0.38b 148.0±3.1a 744.5±10.5b雄性 5g/kg 9.54±0.13ab 8.08±0.12b 151.0±1.5ab 720.0±22.0b 10g/kg 9.44±0.31a 7.84±0.43b 149.5±6.5a 717.5±13.5b空白對照組 9.59±0.18ab 8.18±0.38b 152.0±0.1abc 724.5±18.5b 2.5g/kg 9.93±0.03b 6.84±0.39a 158.0±0.5d 545.5±18.5a雌性 5g/kg 9.56±0.27ab 6.52±0.07a 157.5±0.5cd 531.0±25.0a 10g/kg 9.69±0.07ab 6.60±0.27a 153.0±0.1abcd 556.0±5.0a空白對照組 9.75±0.34ab 6.73±0.14a 156.0±4.0bcd 557.5±19.5a

表4 P2發酵液對小鼠血液生化指標的影響(±s，n=3)Table 4 Effect of fermentation broth of P2 strain on mouse blood biochemical indexes (±s，n=3)

表4 P2發酵液對小鼠血液生化指標的影響(±s，n=3)Table 4 Effect of fermentation broth of P2 strain on mouse blood biochemical indexes (±s，n=3)

性別 組別 血清白蛋白 谷丙轉氨酶活 谷草轉氨酶 尿素氮含量/ 膽固醇含量/ 肌酐含量/ 血糖含量/ 甘油三酯含量/ 總蛋白含量/含量/(g/L) 力/(U/L) 活力/(U/L) (mmol/L) (mmol/L) (μmol/L) (mmol/L) (mmol/L) (g/L)2.5g/kg 43.71±0.34ab 34.30±0.26a 111±14a 8.32±1.30a 3.14±0.21b 61.7±2.3a 8.79±0.43b 1.73±0.28a 68.12±0.61ab雄性 5g/kg 44.63±0.48ab 34.42±0.26a 107±18a 8.77±1.77a 3.58±0.17b 65.1±2.2ab 8.46±0.17b 1.55±0.21a 67.23±0.74a 10g/kg 43.12±0.37a 33.91±0.45a 118±8a 8.25±1.35a 3.18±0.09b 63.6±4.0a 8.58±0.23b 1.59±0.18a 68.31±0.54ab空白對照組 43.25±0.20a 34.17±0.18a 113±12a 8.83±1.44a 3.52±0.27b 63.3±4.5a 8.82±0.35b 1.68±0.21a 67.81±0.34ab 2.5g/kg 45.13±0.39b 35.52±0.21b 107±7a 6.44±1.08a 2.54±0.13a 67.9±2.5b 7.17±0.20a 1.78±0.50a 68.76±0.37b雌性 5g/kg 44.67±0.49ab 35.83±0.12b 105±11a 6.55±1.28a 2.67±0.18a 71.1±1.3b 7.02±0.39a 1.76±0.44a 68.61±0.66b 10g/kg 45.72±0.34b 36.11±0.17b 109±7a 6.62±0.95a 2.29±0.45a 67.8±3.4ab 7.08±0.34a 1.64±0.28a 67.42±0.48ab空白對照組 44.51±0.34ab 36.54±0.11b 111±3a 6.59±1.19a 2.64±0.36a 65.3±4.0ab 7.12±0.32a 1.81±0.38a 69.13±0.55b

2.5.2.3 小鼠血液生化指標分析

由表4可知，小鼠的血清白蛋白、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、尿素氮、膽固醇、肌酐、血糖、甘油三酯和總蛋白的含量與陰性對照組之間無明顯差異(P＞0.05)。

2.5.2.4 小鼠解剖結果

各飼喂劑量組的小白鼠解剖觀察結果顯示：各臟器顏色、形狀、大小等均未見病變。說明通過對該菌株進行毒理學實驗，表明各實驗組小白鼠行為體征、臟體、血液指標和生化指標與空白對照組之間無顯著差異，可初步判定該菌株是安全無毒的。

目前應用于干香腸表面處理的霉菌發酵菌株都屬于青霉屬，如納地青霉(Penicillium nalgiovense)、產黃青霉(P.chrysogenum)、卡門培爾干酪青霉(P.camemberti)[28]。Benito等[29]從干腌火腿中分離得到一株菌株Penicillium chrysogenum，這個菌株在各種試驗中均顯示無毒性，且具有較強的降解蛋白質的能力，能降解肌肉蛋白質產生多肽和游離氨基酸。Nunez等[30]研究伊比利亞火腿上的霉菌菌相構成及其安全性評價，認為不產毒的產黃青霉(P.chrysogenum)可作為火腿的發酵劑。蔣云升等[21]從如皋火腿上分離得到一株產蛋白酶、脂肪酶活性較強的產黃青霉，并將該菌株涂布接種于腌腿表面，生產的火腿香氣濃郁。

3 結 論

3.1 利用察氏培養基、PDA培養基和孟加拉紅培養基，從四川自然發酵香腸中共分離出121株霉菌，其中主要是青霉(Pe n ic illiu m)、毛霉(Mu c o r)和曲霉(Asperillus)。通過脂肪酶活性和蛋白酶活性測試，得到8株具有脂肪酶和蛋白酶活性的菌株，其中一株菌株同時具有較強的蛋白酶和脂肪酶活性。

3.2 通過對菌株的菌落及顯微鏡觀察、ITS序列測定，結果顯示原始編碼P2的菌株和Penicillium chrysogenumstrain F2 (HQ380757)同源性達到98%。

3.3 對P2菌株進行毒理學實驗結果顯示發酵液對小鼠的行為體征、血液指標、生化指標以及臟器顏色、形狀、大小均無明顯的不良影響。因此可初步判定菌株P2的發酵液產品符合GB 15193.1—2003《食品安全性毒理學評價程序》的要求，是安全無毒的。

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Isolation and Identification of Proteinase and Lipase Producing Mould from Sichuan Sausages

YANG Yong，CHENG Yan *，LIAO Ding-rong，SHUAI Jin
(College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

A total of 121 mould strains were isolated from the surface of naturally fermented Sichuan sausage, which belonged toAspergillus,PenicilliumandMucor. A strain with the highest proteanase and lipase activities named as P2 was screened out of them by primary and secondary screening. According to its morphological and molecular biological characteristics, P2 was identified asPenicillium chrysogenum. Toxicological tests were carried out to test the safety of P2. The data obtained showed that the behavior, blood indicators, biochemical parameters and viscera appearance of tested mice revealed no significant difference compared to those of control mice (P＞ 0.05), indicating that P2 is a safe and non-toxic mould.

Sichuan sausage；mould；proteinase；lipase；isolation；identification

TS201.3

A

1002-6630(2012)15-0246-06

2011-11-28

四川省教育廳科研計劃項目(11ZA082)

楊勇(1969—)，男，副教授，博士，研究方向為肉品科學與技術。E-mail：yangyong676@163.com

*通信作者：程燕(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為肉品科學與技術。E-mail：binghuowangqing@126.com