嗜酸乳桿菌對β-乳球蛋白過敏誘發Thl/Th2細胞平衡的影響

李艾黎，孟祥晨,*，徐 漸，邵 紅，馬冬雪

(1.東北農業大學 乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030；2.東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030)

嗜酸乳桿菌對β-乳球蛋白過敏誘發Thl/Th2細胞平衡的影響

李艾黎1，孟祥晨1,*，徐 漸2，邵 紅1，馬冬雪1

(1.東北農業大學 乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030；2.東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030)

目的：觀察嗜酸乳桿菌對牛乳β-乳球蛋白(BLG)致敏小鼠Th1/Th2細胞平衡及血清抗體水平的影響，以研究其緩解過敏反應的作用。方法：用牛乳BLG和弗氏佐劑的混合液腹腔注射誘發BALB/c小鼠致敏，建立動物過敏模型。將實驗動物隨機分為空白組、過敏組與不同劑量的嗜酸乳桿菌組。采用ELISA法測定各組小鼠血清總IgE、BLG特異性IgE和總IgG含量。體外分離培養各組小鼠脾淋巴細胞，采用ELISA法檢測細胞上清液中Th1型細胞因子(IL-12、IFN-γ)和Th2型細胞因子(IL-4)的水平。結果：中、高劑量嗜酸乳桿菌組小鼠的IFN-γ/IL-4比值(代表Th1/Th2細胞平衡)顯著高于過敏組(P＜0.05)；而其血清中的總IgE、BLG特異性IgE和總IgG水平顯著低于過敏組(P＜0.05)，與空白組相比無差異性(P＞0.05)。結論：嗜酸乳桿菌干預可改善小鼠的BLG過敏癥狀，其作用可能與促進Th1占優勢的Th1/Th2細胞平衡，阻斷IgE及IgG分泌相關。

嗜酸乳桿菌；β-乳球蛋白；牛乳過敏

牛乳β-乳球蛋白(β-lactoglobulin，BLG)被視為最主要的乳過敏原蛋白質之一[1]，能導致Th1/Th2型免疫反應失衡，誘發特異性IgE抗體介導的食物過敏反應[2]，嚴重影響部分人群對優質乳蛋白的吸收，尤其危及嬰幼兒的身體健康[3]。包括注射抗組胺、肥大細胞穩定劑及免疫佐劑等在內的傳統治療方法都具有一定副作用[4]，治療效果難以令人滿意。因此，尋找安全有效的防治牛乳β-乳球蛋白過敏的措施十分必要。

近年來，許多研究學者[5-7]希望能借助乳酸菌來有效減緩過敏反應，并減少藥物的使用量。因為許多乳酸菌在腸道中能通過平衡細胞和體液免疫應答，使免疫系統處于健康和穩定的狀態。但采用乳酸菌來防治牛乳過敏仍屬新興領域，缺乏相關實驗研究數據以及相關作用機制的研究來支持該措施的進一步應用和推廣。

本研究基于乳酸菌與抑制食物過敏的發生、發展之間的緊密聯系，通過建立BLG致敏動物模型，研究給予嗜酸乳桿菌對致敏模型動物過敏反應的干預作用，為乳酸菌防治食物過敏提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

嗜酸乳桿菌由東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室分離保存。

乳清粉 新西蘭進口；BCA試劑盒 上海玉博生物科技有限公司；IL-12、IFN-γ、IL-4 ELISA試劑盒 美國R&D公司；總IgE試劑盒 美國Bethyl公司；羊抗鼠IgE酶標二抗 英國AbD Serotec公司；羊抗鼠IgG酶標二抗 中國中杉金橋公司；RPMI1640培養液 美國Gibco公司；胎牛血清 杭州四季青生物工程材料公司；淋巴細胞分離液 北京Salarbio公司；牛乳β-乳球蛋白標品、弗氏完全佐劑(FCA) 美國Sigma公司。

1.2 動物

雌性清潔級BALB/c小鼠，6～8周齡，購自哈爾濱腫瘤醫院實驗動物中心。飼養環境溫度(23±2)℃，相對濕度50%～75%，標準小鼠飼料喂養。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化與菌懸液的制備

嗜酸乳桿菌接種于MRS液體培養基中，37℃培養18h后3000×g離心10min收集菌體，用滅菌0.01mol/L、pH 7.4的PBS離心洗滌重懸，調整所得菌懸液濃度約為2×1010CFU/mL。上述菌懸液經100℃、30min熱處理后(檢驗證實無活菌存在，且仍保持正常細菌形態)，冷凍干燥保存備用。

1.3.2 牛乳β-乳球蛋白的制備[8]

以乳清粉為原料，采取高鹽低pH值法分離純化β-乳球蛋白。透析除鹽后凍成干粉備用，SDS-PAGE電泳鑒定蛋白純度，采用BCA蛋白測定試劑盒(增強型)測定β-乳球蛋白含量。

1.3.3 動物模型的建立[9]

小鼠購進后適應性喂養4d，隨機分組(每組8只)，即空白組、致敏組以及嗜酸乳桿菌組。自第1天起，嗜酸乳桿菌組小鼠灌服低、中、高劑量(0.2、1.0、5.0mg)的菌液0.1mL/(d·只)，共28d，空白組同時以等量生理鹽水灌胃。致敏組和嗜酸乳桿菌組小鼠在第7、21、28天給予腹腔注射0.2mL 0.5mg/mL的過敏原(1mL弗氏佐劑＋1mL 1mg/mL BLG)，空白組小鼠腹腔注射等量生理鹽水。于實驗的第30天，即末次腹腔注射48h后檢測指標。

1.3.4 ELISA法檢測細胞因子[10]

無菌取各組小鼠脾臟，用玻璃針芯在200目篩網上研磨后，加入到RPMI 1640培養液中制成單細胞懸液。加入淋巴細胞分離液進行離心，分離出淋巴細胞，再用RPMI 1640培養液洗滌(4000r/min) 2次。調細胞密度為2×106個/mL。將細胞與含有100mL/L小牛血清的RPMI 1640培養基及BLG (終質量濃度1g/L)加入到96孔培養板中，每孔總體積200μL，每組設3個重復。在37℃、50mL/L CO2培養箱飽和濕度條件下培養48h后，離心收集上清。嚴格按照各ELISA試劑盒說明書進行操作，在波長450nm處用酶標儀測定各孔的光密度值，從相應的標準曲線查得各樣品的IL-12、IFN-γ、IL-4水平。

1.3.5 ELISA法檢測抗體水平[11]

各組小鼠摘除眼球放血，離心后吸取血清，嚴格按照各抗體試劑盒說明書檢測小鼠血清中總IgE、BLG特異性IgE和總IgG含量。

1.4 數據處理

采用SPSS 11.0軟件進行統計分析，各組定量檢測數據以x－±s表示，組間比較進行單因素方差分析(Oneway ANOVA)，兩兩比較采用LSD法；P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 嗜酸乳桿菌對致敏小鼠Th1/ Th2細胞平衡的影響

表1 嗜酸乳桿菌對BLG致敏小鼠Th1/Th2細胞分泌的影響(±s,n＝3)Table 1 Effect of Lactobacillus acidophilus on Th1/Th2 cell cytokine secretion in BLG sensitized mice (±s,n＝3)

表1 嗜酸乳桿菌對BLG致敏小鼠Th1/Th2細胞分泌的影響(±s,n＝3)Table 1 Effect of Lactobacillus acidophilus on Th1/Th2 cell cytokine secretion in BLG sensitized mice (±s,n＝3)

注：a.與致敏組相比，差異顯著(P＜0.05)；b.與空白組相比，差異顯著(P＜0.05)。下同。

組別IL-12IFN-γIL-4IFN-γ/ IL-4空白組4.74±0.11623.08±23.3980.34±3.357.75±0.57致敏組4.18±0.10344.87±29.87103.19±4.363.34±0.25低劑量組4.49±0.12543.21±10.51ab77.49±3.81a7.01±0.63a嗜酸乳桿菌中劑量組4.52±0.07608.97±17.34a44.98±5.59ab13.53±0.89ab高劑量組4.61±0.1618.13±12.34a42.61±4.35ab14.50±1.05ab

由于Th1、Th2細胞的比例同IFN-γ和IL-4的分泌水平密切相關，故以IFN-γ/IL-4為代表研究乳酸菌對淋巴細胞Th1/Th2平衡的影響。由表1可知，與致敏組相比，不同劑量嗜酸乳桿菌組小鼠的IL-4質量濃度顯著下降(P＜0.05)，而IFN-γ分泌值明顯增高(P＜0.05)。由于嗜酸乳桿菌中、高劑量組比嗜酸乳桿菌低劑量組更明顯地促進了IFN-γ的分泌(P＜0.05)，使其IFN-γ/IL-4顯著高于空白組和過敏組(P＜0.05)。

2.2 嗜酸乳桿菌對致敏小鼠抗體分泌的影響

圖1 嗜酸乳桿菌對BLG致敏小鼠血清中總IgE(A)、BLG特異性IgE(B)和總IgG(C)抗體含量的影響Fig.1 Effect of Lactobacillus acidophilus on serum concentrations of total IgE (A), BLG-specific IgE (B) and total IgG (C) of BLG-sensitized mice

由圖1可知，BLG能夠誘導小鼠總IgE、BLG特異性IgE和總IgG水平升高，且顯著高于空白組(P＜0.05)。用不同劑量的嗜酸乳桿菌干預致敏小鼠后，均能不同程度地降低其血清中抗體的含量，且具有一定的量效關系，差異具有統計學意義(P＜0.05)。特別是中、高劑量嗜酸乳桿菌組更有效地抑制了總IgE、BLG特異性IgE和總IgG的分泌(P＜0.05)，且與空白組相比差異不顯著(P＞0.05)。

3 討 論

研究者多認為Th2細胞占優勢的Th1/Th2細胞失衡是過敏發病最重要的免疫學異常[2]：即Th2細胞作為介導體液免疫的重要細胞，其數量增加、功能亢進的最終結果是誘導B細胞產生高水平的IgE應答和嗜酸性粒細胞活化，并引起組胺、白三烯等多種炎性介質釋放，導致過敏反應發生。

以往研究表明乳桿菌細胞壁組分可以作為一種主要的病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)[12]，例如未甲基化的CpG、肽聚糖(peptidoglycan，PG)和脂磷壁酸(lipoteichoic acid，LTA)等[13]，它們被腸上皮細胞或樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)上的Toll樣受體家族 (Toll-like receptor，TLRs)識別后，通過TIR區域向胞漿內傳導信號，激活NF-κB等轉錄因子和蛋白激酶[14]，釋放細胞因子、表達共刺激分子等[15]，從而激活Th0細胞向不同的亞型細胞分化(如Th1、Th2細胞)，在天然免疫、炎癥反應和獲得性免疫中發揮作用。本研究中熱滅活的嗜酸乳桿菌能誘導致敏小鼠淋巴細胞分泌IL-12和IFN-γ，降低IL-4水平，使得IFN-γ/IL-4顯著升高，促進了Th1型免疫應答，即通過逆轉Th2細胞過度亢進來阻斷IgE的分泌，這可能是其抑制過敏發生的機理之一。該結果也提示乳酸菌細胞的完整性，而非菌的存活性，可能是其調節淋巴細胞免疫功能的決定因素。

IgG抗體在過敏反應中的作用也日益受到重視，其中IgG4型抗體與食物過敏密切相關，它可吸附于肥大細胞表面而參與病理過程[16]。本研究中BLG的激發亦使過敏組小鼠血清總IgG水平升高，提示嗜酸乳桿菌可能通過下調總IgG分泌量來緩解過敏反應，其具體機制有待進一步研究。

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Effect of Lactobacillus acidophilus on β-Lactoglobulin Induced Mouse Th1/Th2 Cell Imbalance

LI Ai-li1，MENG Xiang-chen1,*，XU Jian2，SHAO Hong1，MA Dong-xue1
(1. Key Laboratory of Dairy Science, Ministry of Education, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China；2. College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Objective: To investigate the effects of Lactobacillus acidophilus on the Th1/Th2 cell balance and antibody production in bovine β-lactoglobulin (BLG)-sensitized mice and evaluate its efficacy to relieve consequent allergic reactions. Methods: BALB/c mice were intraperitoneally injected with a mixture of milk BLG and Freund,s adjuvant to create BLG-sensitized mouse models. The mice were randomly divided into blank group, allergic group and different dose of Lactobacillus acidophilus group. The total IgE, BLG-specific IgE and total IgG contents in the serum of mice were measured by ELISA. Splenic lymphocytes were isolated and cultured in vitro to detect the levels of Thl type cytokine (IL-12, IFN-γ) and Th2 type cytokine (IL-4) in the supernatant by ELISA. Results: The IFN-γ/IL-4 ratio, which represents the Th1/Th2 cell balance, increased significantly in both middle- and high-dose Lactobacillus acidophilus groups compared to the allergic group (P＜0.05). At the same time, their serum levels of total BLG-IgE and total IgG decreased significantly (P＜0.05), but showed no significant difference compared to the blank control (P＞0.05). Conclusion: Intragastric administration of Lactobacillus acidophilus may be effective in preventing and alleviating BLG allergic symptoms by restoring the Th1/Th2 cell balance to Th1 dominance and by inhibiting IgE and IgG production.

Lactobacillus acidophilus；β-lactoglobulin；milk allergy

R392.12

A

1002-6630(2012)15-0279-04

2011-06-23

黑龍江省教育廳科學技術研究項目(12511052)

李艾黎(1978—)，女，副教授，博士，研究方向為乳品微生物及其生物工程。E-mail：aili-mail@163.com

*通信作者：孟祥晨(1970—)，女，教授，博士，研究方向為乳品微生物及其生物工程。E-mail：xchmeng@163.com