N+注入誘變選育β-環狀糊精葡萄糖基轉移酶高產菌株及其發酵條件優化

張洪斌，凌國慶，胡雪芹，凡 寧

(合肥工業大學制藥工程系，安徽 合肥 230009)

N+注入誘變選育β-環狀糊精葡萄糖基轉移酶高產菌株及其發酵條件優化

張洪斌，凌國慶，胡雪芹，凡 寧

(合肥工業大學制藥工程系，安徽 合肥 230009)

以一株產β-環狀糊精葡萄糖基轉移酶的蠟狀芽孢桿菌BC-0801為出發菌株，利用10keV，劑量為40× 2.5×1013ions/cm2氮離子進行誘變選育，獲得一株高產β-環狀糊精葡萄糖基轉移酶的突變體BC-0802。對該突變體BC-0802發酵培養基的碳源、氮源及無機離子進行單因素試驗分析，采用3個因素正交試驗確定其最佳發酵培養基成分質量濃度及發酵條件為：玉米粉30g/L、酵母浸膏15g/L、K2HPO4 1g/L，發酵溫度30℃、pH 9.0、接種量2%、發酵周期36h。結果表明；突變體的平均酶活力可達3415.8U/mL，相較于出發菌株酶活力提高了3.67倍，且該突變體的遺傳穩定性較好。

N+注入；β-環狀糊精葡萄糖基轉移酶；篩選；誘變；工藝優化

環狀糊精(cyclodextrin，CD)是直鏈淀粉在由芽孢桿菌產生的環糊精葡萄糖基轉移酶作用下生成的一系列環狀低聚糖的總稱，通常含有6～12個D-吡喃葡萄糖單元，根據組成葡萄糖基個數不同分別叫做α-、β-、γ-環狀糊精(葡萄糖基數分別為6、7、8)[1]。其化學結構如圖1所示。β-環狀糊精分子呈錐形的圓環狀，它的內側是由—CH及葡萄糖苷鍵的氧原子組成，呈疏水性；而它的外側開口處一端是2,3位羥基，另一端是6位羥基，因而C D外側呈親水性；由于其“內疏水，外親水”的特殊分子結構，使得CD能與多種有機小分子形成特殊結構的包合物，改變配體物質的物理化學性質，可起到保護、抗光、抗熱、提高溶解度、改變劑型、掩蓋異味、提高生物利用度等特殊作用[2]。由于β-環狀糊精在食品、醫藥、化工、農業等許多方面有重要用途，篩選獲取用來生產β-環狀糊精的高活性β-環狀糊精葡萄糖基轉移酶已經越來越受到重視。

β-環狀糊精葡萄糖基轉移酶(β-cyclodextrin glucanotransferase，β-CGTase)是催化淀粉、糖原、麥芽寡聚糖等葡萄糖聚合物合成β-CD的酶，屬于α-淀粉酶家族，可用于β-CD的生產[3]，還可用于一些糖類的化學改性[4]。Park等[5]利用β-CGTase的轉糖基作用將纖維二糖合成一種新的四糖，經鑒定是一種新的物質。β-CGTase至今已從數10種微生物中分離得到，如Bacillus macerans[6]、B.ohbensis[7]、Klebsiella pneumonia[8]、B. stearothermophilus[9]、Bacillus circulans[10]。大多數的β-CGTase由于活力低而無法滿足工業生產，為了獲取適合工業化生產的β-CGTase產酶菌株，對產菌株進行誘變育種，以提高酶的活力，是選育β-CGTase高產菌株的關鍵手段。廖偉等[11]報道了一株產β-CGTase的菌株，原始菌株的酶活為634.37U/mL，經誘變后酶活力達到了1500U/mL左右。何飛燕等[12]通過紫外-氯化鋰的雙重誘變育種的方法，將從土壤分離物中篩選到1株β-CGTase產生菌gxmf1，經誘變處理后，篩選得到突變株B15，酶活力達5416U/mL，較出發菌株提高255%。誘變育種的方法有很多，特別是N+注入誘變育種，能以較小的損傷得到較高的正突變率和較廣譜的突變率，有成本低廉、對人體及環境無害的優點，是一種新型的誘變育種的方法[13]，因此，利用離子注入誘變進行微生物誘變選育在科學研究中得到廣泛的應用[14-15]。但是到目前為止，對用N+注入誘變的方法篩選高產β-CGTase的研究，文獻報道較少。

圖1 α-、β-、γ-環狀糊精的化學結構Fig.1 Chemical structures of α-, β-, andγ- cyclodextrin

本實驗通過從土壤篩選并得到一株高產β-CGTase的菌株BC-0801。通過對其進行N+注入誘變育種，得到高產β-CGTase的突變體BC-0802，并優化其培養基和發酵條件。該菌株所產的β-CGTase活性較高，且菌株的遺傳穩定性較好，具有適合工業生產β-環狀糊精的應用潛力，對于β-環狀糊精葡萄糖基轉移酶的工業化應用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

產β-環狀糊精葡萄糖基轉移酶的Bacillus cereus BC-0801，本實驗室保藏。

1.1.2 試劑

甲基橙、碘液醋酸、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、酚酞，以上均為分析純；淀粉、酵母浸膏、蛋白胨、瓊脂粉等。

1.1.3 培養基

篩選培養基(g/L)：可溶性淀粉10、蛋白胨10、酵母浸膏5、K2HPO41、MgSO4·7H2O 0.5、酚酞0.3、甲基橙0.1、瓊脂粉20。

發酵培養基(g/L)：玉米粉10、玉米漿10、蛋白胨10、酵母浸膏5、K2HPO41、MgSO4·7H2O 0.5。

1.2 儀器與設備

SPX-150B生化培養箱 中國科學院等離子研究所；WFZ800-D3B紫外-可見分光光度計 北京瑞利分析儀器公司；HC-3018R高速冷凍離心機 科大創新股份有限公司中佳分公司；ZHWY-2102恒溫搖床 上海智城分析儀器制造有限公司；COIC XSZ-G光學顯微鏡 重慶光學儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 低能N+注入工藝及樣品處理

取新鮮活化斜面，用無菌水洗脫后制成濃度約為1×106個/mL的懸液，取5mL合適濃度的菌懸液和5mL 30%的甘油混合，搖勻后取0.1mL均勻涂布在無菌平板上，置于超凈操作臺下由無菌風吹干后進行N+注入。該工作在中國科學院合肥科學島離子束生物工程重點實驗室進行，選擇注入能量為10keV，注入劑量為(10～120)× 2.5×1013ions/cm2，真空度為10-3Pa。離子注入完畢后，用1mL無菌水清洗平板上的菌膜，用移液槍反復沖洗幾次以使菌液均勻，然后移取0.1mL于無菌空白平板上，倒入融化的篩選固體培養基(約50℃)，振蕩均勻，30℃恒溫培養箱倒置培養48h，記錄單菌落的形態及個數，繪制存活率曲線。

1.3.2 高產β-CGTase突變菌株的篩選

以菌株產β-CGTase水解淀粉的酶活力大小進行篩選?；钚跃甑暮Y選的原理是根據選的原理是根據β-CGTase可以水解淀粉產生β-環狀糊精，而β-環狀糊精與甲基橙和酚酞染料反應形成復合物，可在培養基平板上出現黃色透明圈[11]。選取平板上黃色透明圈較大的菌株，用搖瓶復篩，再對復篩獲得的突變菌株的穩定性進行考察。

1.3.3 碳源對β-CGTase活力的影響

1.3.3.1 不同碳源對酶活力的影響

選擇玉米粉、玉米漿、可溶性淀粉、葡萄糖作為碳源，在不含碳源的培養基上分別添加10g/L以上幾種碳源，接種量為5%，30℃、200r/min培養72h后，測發酵液的酶活力。

1.3.3.2 碳源質量濃度的選擇

選擇較為廉價的玉米粉作為碳源，在不含碳源的發酵培養基上分別添加5、10、15、20、25、30g/L的玉米粉，接種量為5%，30℃、200r/min培養72h后，測發酵液的酶活力。

1.3.4 氮源對β-CGTase活力的影響

1.3.4.1 不同氮源對酶活力的影響

選擇蛋白胨、酵母浸膏、NH4NO3、(NH4)2SO4為氮源，在不含氮源的培養基上分別添加10g/L以上幾種氮源，接種量為5%，30℃、200r/min培養72h后，測發酵液的酶活力。

1.3.4.2 氮源質量濃度的選擇

選擇酶活較高的酵母浸膏作為氮源，在不含氮源的發酵培養基上分別添加2.5、5、7.5、10、15、20g/L的酵母浸膏，接種量為5%，30℃、200r/min培養72h后，測發酵液的酶活力。

1.3.5 無機離子對產酶的影響

1.3.5.1 不同無機離子對產酶的影響

選取對實驗影響較大K2HPO4、MgSO4·7H2O、CaCl2這3種無機鹽組分，在不含其他無機鹽的培養基中添加上述幾種無機鹽，接種量為5%，30℃、200r/min培養72h后，測發酵液的酶活力。

1.3.5.2 無機鹽質量濃度的選擇

選擇酶活較高的K2HPO4作為無機鹽，在不含無機鹽的發酵培養基上分別添加0.5、1、1.5、2、2.5、3g/L的K2HPO4，接種量為5%，30℃、200r/min培養72h后，測發酵液的酶活力。

1.3.6 初始pH值對產酶的影響

該蠟狀芽孢桿菌為嗜堿性，所以選取pH值的梯度為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0。按5%的接種量接種，然后將培養基在30℃，200r/min的搖床上培養36h，取樣，在700nm波長處測定酶活力。

1.3.7 接種量對產酶的影響

分別選取接種量為2%、4%、6%、8%、10%。然后將培養基在30℃，200r/min搖床培養36h，取樣，在700nm波長處測定酶活力。

1.3.8 發酵時間對產酶的影響

在30℃、200r/min發酵24h后每隔6h定時取樣，在700nm波長處測酶活力。

1.3.9 發酵溫度對產酶的影響

分別選取28、29、30、31、32℃，然后將培養基在30℃、200r/min的搖床上培養36h，取樣，在700nm波長處測酶活力。

1.3.10 正交試驗設計

根據碳源、氮源、無機鹽的單因素分析結果，設計了三因素三水平正交試驗因素表，在接種量為5%，30℃、200r/min培養72h的條件下，測定發酵液的酶活力。

1.3.11 酶活力的測定

取10μ L適當稀釋的酶液，加入0.2mol/L甘氨酸-NaOH緩沖液(pH 8.5)0.2mL，再加入0.2%可溶性淀粉0.2mL，振蕩，于40℃水浴10min，立即加入0.5mL/L醋酸0.5mL終止反應，然后加入0.005%碘液顯色3mL，同時以蒸餾水為空白，不加酶液為對照，在700nm波長處測定吸光度，一個酶活力單位定義為使吸光度下降10%的酶量。

式中：A0為對照組的吸光度；A為樣品的吸光度。

1.4 離子注入誘變效果的計算

1.4.1 存活率計算

以不經誘變的菌株為對照組，再分別統計對照組和離子注入組的菌落總數，按式(2)計算存活率。

1.4.2 突變率的計算

挑取離子注入后的單菌落分別進行搖瓶發酵實驗，測定發酵液的酶活力，以原始出發菌株為對照，酶活力提高5%為正突變，降低5%為負突變，其他視為未突變。正突變率、負突變率、總突變率的計算按式(3)、(4)、(5)計算。

2 結果與分析

2.1 N+注入誘變篩選高產β-CGTase突變菌株

2.1.1 誘變劑量的確定

對Bacillus cereus BC-0801采用N+注入誘變，在10keV注入能量下，統計不同劑量的存活菌落數，計算各注入劑量的致死率，繪制致死率曲線，如圖2所示。分別在不同劑量下挑取單菌落進行搖瓶發酵，測定酶活力，同時與原始出發菌株對照計算突變率。結果見圖3。

圖2 N+注入劑量對菌體存活率的影響Fig.2 Cell survival of Bacillus cereus treated with different doses of N+ implantation

由圖2可知，當N+注入劑量低于20×2.5×1013ions/cm2時，菌體的存活率隨注入劑量的增大而迅速降低；當劑量達到約40×2.5×1013ions/cm2時，存活率隨著注入劑量的增加逐漸增加，在40×2.5×1013ions/cm2處達到最大，菌株的存活率為26.6%。但超過40×2.5× 1013ions/cm2之后，存活率又逐漸下降，整個變化曲線呈“馬鞍型”。

圖3 N+注入劑量對菌體突變的影響Fig.3 Effect of N+ implantation dose on bacterial mutation

由圖3可知，隨著注入劑量的增加，菌體的突變率在增加，而菌體的正突變率則隨著注入劑量的增加呈現先增加后減小的趨勢，在40×2.5×1013ions/cm2時達到最大，超過此劑量后，菌體的突變率雖然增加，但正突變率卻在減小。故選定在該劑量下進行離子注入誘變，可以得到更多的正突變。

2.1.2 誘變、篩選的高產β-CGTase菌株及遺傳穩定性采用最佳注入劑量40×2.5×1013ions/cm2對Bacillus cereus BC-0801進行N+注入誘變處理，挑取誘變處理后可以產生透明圈的約200株菌株進行搖瓶復篩，最終得到1株耐堿性中溫β-CGTase產量較高的菌株，編號為BC-0802。突變菌株從6h后開始進入對數生長期，24h后進入平臺期，這時β-CGTase的酶活力逐漸上升，在36h后，培養基中的β-CGTase的酶活力達到最大，可達3500U/mL。將突變菌株在平板上轉接8代后，將不同傳代次數的菌株在最適條件進行搖瓶發酵，測定發酵液的酶活力，BC-0802各代搖瓶發酵β-CGTase的酶活力穩定在(2000±200)U/mL范圍內，說明該菌株的穩定性比較好。

2.2 碳源對酶活力的影響

2.2.1 不同碳源對酶活力的影響

表1 不同碳源對菌株產β-CGTase的影響Table 1 Effect of different carbon sources on β-CGTase production by Bacillus cereus BC-0802

碳源是微生物能量的主要來源，不同碳源對菌株產β-CGTase酶活的影響結果見表2?？梢钥闯?，突變菌株BC-0802在以玉米粉為碳源時產酶的酶活力比其他碳源的高很多，且從市場成本來考慮，玉米粉也是最好的碳源?？梢?，玉米粉是突變菌株發酵培養基的最適碳源。

2.2.2 碳源質量濃度的確定

圖4 碳源質量濃度的確定Fig.4 Effect of corn flour concentration in the medium onβ-CGTase production by Bacillus cereus BC-0802

由圖4可知，發酵產酶的酶活力是隨著玉米粉的質量濃度增加而增加，但到25g/L左右，增加趨于平緩，在30g/L時最大，但如果玉米粉的質量濃度如果超過30g/L，發酵培養基會有很多懸浮的玉米粉，會對發酵產生不利影響，所以玉米粉的最適質量濃度為30g/L。

2.3 氮源對酶活力的影響

2.3.1 不同氮源對酶活力的影響

表2 不同氮源對菌株產β-CGTase的影響Table 2 Effect of different nitrogen sources on β-CGTase production by Bacillus cereus BC-0802

從表2可以看出，突變菌株BC-0802在以酵母浸膏的為氮源時，產酶的酶活力比其他氮源高很多；以(NH4)2SO4和NH4NO3作為氮源時，產酶活力較小，說明菌株不太適合以無機氮源發酵產酶，結果表明，酵母浸膏為突變菌株的最適氮源。

2.3.2 氮源質量濃度的確定

圖5 氮源質量濃度的確定Fig.5 Effect of yeast extract concentration in the medium on β-CGTase production by Bacillus cereus BC-0802

由圖5可知，隨著酵母浸膏質量濃度的增加，產酶的酶活力會增加；當酵母浸膏的質量濃度達到15g/L時，β-CGTase的酶活力最高；但隨著酵母浸膏質量濃度的繼續增加，產酶的酶活逐漸降低，發酵液的顏色逐漸加深，為后面的酶分離純化帶來困難，所以選定酵母浸膏的質量濃度為15g/L。

2.4 無機鹽對酶活力的影響

2.4.1 不同無機鹽對酶活力的影響

表3 不同無機鹽對菌株產β-CGTase的影響Table 3 Effect of different inorganic salts on β-CGTase production by Bacillus cereus BC-0802

從表3可以看出，突變菌株BC-0802在以K2HPO4為無機鹽時產酶的酶活力最高，而且K2HPO4的價格最便宜，所以選擇K2HPO4為最適無機鹽?？梢?，K2HPO4為突變菌株發酵培養基的最適無機鹽。

2.4.2 無機鹽質量濃度的確定

圖6 無機鹽質量濃度的確定Fig.6 Effect of K2HPO4 concentration in the medium on β-CGTase production by Bacillus cereus BC-0802

由圖6可知，隨著K2HPO4質量濃度的增加，突變菌株產酶活力逐漸增加，在1g/L時達到最高；當K2HPO4質量濃度超過1g/L時，突變菌株產酶活力逐漸降低，可能是無機鹽質量濃度過高會抑制該菌株的生長和酶的表達。K2HPO4的最佳質量濃度為1g/L。

2.5 初始pH值對產酶的影響

圖7 初始pH對酶活力的影響Fig.7 Effect of initial medium pH onβ-CGTase production by Bacillus cereus BC-0802

由圖7可知，隨著pH值的增加，突變菌株產酶的活力在增加，在pH9.0時酶活力最高；當pH值超過9.0時，突變菌株產酶的活力隨pH值的增大反而降低，可能是堿性太強，抑制了酶的活性。該菌株適宜在pH值為9.0條件下發酵產酶。

2.6 接種量對產酶的影響

圖8 接種量對酶活力的影響Fig. 8 Effect of inoculum size on β-CGTase production by Bacillus cereus BC-0802

由圖8可知，突變菌株產酶的活力隨著接種量的增加而增加，在接種量為2%時酶活最高，但當接種量超過2%后，突變菌株產酶活力略有降低。該突變菌株發酵的最佳接種量為2%。

2.7 發酵時間對產酶的影響

圖9 發酵時間對酶活力的影響Fig.9 Effect of culture time onβ-CGTase production by Bacillus cereus BC-0802

由圖9可知，突變菌株產酶的活力隨著發件時間的延長而增加，在36h時達到最大，說明在這段時間酶表達量在增加；在36～48h之間產酶的增量不大，但超過48h后，酶活力反而隨時間的延長而降低，可能是在堿性環境下酶活力有損失。該突變菌株的最適發酵時間為36h。

2.8 發酵溫度對產酶的影響

圖10 發酵溫度對酶活力的影響Fig.10 Effect of culture temperature on β-CGTase production by Bacillus cereus BC-0802

由圖10可知，隨著發酵溫度的增加，突變菌株產酶的活力在增加，在30℃時達到最大，可能是由于隨著溫度的增加有利于該菌株生長，但當溫度繼續升高時，突變菌株的產酶活力反而下降。該突變菌株的最適發酵溫度為30℃。

2.9 培養基配方正交試驗結果

根據單因素試驗結果，對影響β-CGTase酶活力的碳源、氮源、無機鹽離子3個因素按照不同質量濃度進行優化，正交試驗結果見表4。因素的主次順序為：A (碳源)＞B(氮源)＞C(無機鹽)，從直觀分析可知，最優水平為A2B2C3，即玉米粉30g/L、酵母浸膏15g/L、K2HPO41g/L時酶活力最高。

表4 培養基配方正交試驗結果Table 4 Orthogonal array design arrangement and corresponding experimental results for optimization of fermentation medium

2.10 驗證實驗

按照正交試驗所得的最佳發酵條件：玉米粉30g/L、酵母浸膏15g/L、K2HPO41g/L載接種量2%、30℃、200r/min條件下培養48h后，重復5次實驗進行驗證，結果分別是：3457.5、3513.6、3217.2、3420、3470.5U/mL，平均酶活力為3415.8U/mL，結果波動在可信范圍內，故正交試驗結果是合理的。

3 結 論

本實驗室通過N+注入誘變的方法，在10keV，注入劑量為40×2.5×1013ions/cm2的條件下，篩選得到得到一株新的高產β-CGTase的突變體BC-0802。通過對該突變體菌株的培養基和發酵條件進行優化，其在搖瓶發酵時產酶的酶活力可最高達3415.8U/mL，較出發菌株提高了3.67倍，并且能穩定的遺傳。該產酶菌株的遺傳穩定性較好，并且酶活處在較高的水平，適宜用做工業化生產，為β-CGTase的工業應用提供一定的參考。

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Screening of a High-Yield β-Cyclodextrin Glycosyltransferase-Producing Bacillus cereus Strain and Optimization of Its Fermentation Conditions

ZHANG Hong-bin，LING Guo-qing，HU Xue-qin，FAN Ning
(Department of Pharmaceutical Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Bacillus cereus BC-0801, a β-cyclodextrin glycosyltransferase (β-CGTase)-producing strain, was mutagenized by means of low energy (10 keV) N+ion implantation at a dose of 40 × 2.5 × 1013ions/cm2to obtain a high-yield mutant strain designated as BC-0802. The effects of carbon and nitrogen sources and inorganic salt (K2HPO4) in the medium on β-CGTase production by BC-0802 were investigated by one-factor-at-a-time method. The three components were optimized by orthogonal array design method. The optimal fermentation medium was composed of corn flour 30 g/L, yeast extract 15 g/L, K2HPO4 1 g/L. The optimal fermentation conditions were determined as inoculum size 2%, fermentation period 36 h, temperature 30 ℃, and pH 9.0. The average β-CGTase activity of the mutant strain was 3415.8 U/mL (n = 5), which was 3.67 times higher than that of the starting strain. Moreover the mutant strain showed good genetic stability.

N+ion implantation；β-cyclodextrin glycosyltransferase；screening；mutagenesis；technological optimization

Q815

A

1002-6630(2012)15-0239-07

2012-03-23

安徽省長三角科技聯合攻關項目(10140702001)；合肥工業大學大學生創新性實驗計劃項目(2012CXCY467)

張洪斌(1970—)，男，教授，博士，研究方向為生物酶工程。E-mail：zhb5678@163.com