胰腺癌上皮間質轉化的研究現狀與進展

常志剛 田孝東 楊尹默

·綜述與講座·

胰腺癌上皮間質轉化的研究現狀與進展

常志剛 田孝東 楊尹默

上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是指上皮細胞在特定的生理和病理情況下向間質細胞轉化的現象，其定義為具有極性、緊密連接特性的上皮細胞轉換成獨立的、具有移行能力、并能侵入細胞外基質的間質細胞的過程。EMT的概念最早見于發育生物學，主要參與胚胎的發育、組織重建、創傷愈合、心瓣膜和顱面結構以及肌肉骨骼系統的形成，同時與多種慢性疾病(如腎纖維化)的發病機制密切相關。近年來研究還發現EMT過程與腫瘤細胞的生長、浸潤及轉移密切相關。參與調控腫瘤細胞EMT過程的信號通路及相關基因的研究日益受到重視，成為腫瘤研究的熱點[1]。研究表明，經過EMT，腫瘤細胞在功能上增強了移行能力、基質重塑能力及抗凋亡能力，該過程還包括細胞形態學及基因型的改變[1-3]。而EMT的發生與多種蛋白分子、微環境及micro RNA等相關，涉及到多個信號轉導通路和復雜的分子機制。

一、EMT的關鍵分子：E-鈣黏素

鈣連接素是上皮組織中的一類依賴Ca2+的細胞間跨膜粘連糖蛋白分子，主要參與細胞間的連接，分為E-鈣黏素、P-鈣黏素和N-鈣黏素，其中E-鈣黏素對腫瘤侵襲轉移的影響最為重要，同時也是EMT的關鍵分子。E-鈣黏素可與β-連環素(β-catenin)和γ-連環素(γ-catenin)結合，再與α-連環素(α-catenin)相連，形成E-鈣黏素-β-連環素-α-連環素復合體[4]，此復合體再直接連接到肌動蛋白細胞骨架上，用以維持細胞間黏附的穩定性和細胞極性。細胞連接復合體還直接或間接參與細胞的信號轉導，對胚胎發育中的細胞識別、遷移、組織分化以及腫瘤的發生、發展和轉移具有重要作用。在上皮細胞發生間質表型轉化以及腫瘤發生過程中，經常會發現E-鈣黏素表達下調或E-鈣黏素-連環素復合物功能的失調。E-鈣黏素表達下調或抑制可以啟動EMT，并導致腫瘤的浸潤及轉移。E-鈣黏素的表達與腫瘤的侵襲能力呈負相關。染色體丟失、基因突變或E-鈣黏素啟動子的甲基化都可以降低E-鈣黏素表達水平。E-鈣黏素缺失的細胞侵襲性增加，在動物模型中可以引起腺瘤向腺癌的轉化[4]。

二、胰腺癌EMT的誘發因素

多種生長因子可調控EMT，如血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factors, VEGF)、轉化生長因子β(transforming growth factor, TGF-β)、胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor, IGF)、成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，FGF)、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)、骨形態發生蛋白(bone morphogenetic proteins, BMP)等。生長因子與上皮細胞表面相應受體結合，通過細胞內的Ras、Src、Rho、PI3K、Wnt等信號轉導途徑將信號轉入細胞內，活化不同的核內轉錄因子，調節轉導基因的表達，最終促進EMT的發生。

1．TGF-β：TGF-β有3種異構體TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，均屬于結構相關的生長因子超家族，3種TGF-β均可誘導EMT。TGF-β與其受體TβRⅠ、TβRⅡ和TβRⅢ的β聚糖結合，磷酸化Smad 2和Smad 3，進一步與Smad 4結合，轉移入細胞核活化轉錄基因。也可以通過非Smad分子依賴途徑發揮作用，包括GTP酶介導的信號轉導途徑、p38 MAPK途徑、PI3K途徑、TIF-1γ(transcriptional intermediary factor-1γ)等發揮作用。

TGF-β是胰腺癌發生EMT的主要誘導因子之一，免疫組化檢測發現41.4%的胰腺癌患者表達TGF-β1，血清TGF-β表達增高與胰腺癌的預后相關。體外研究也證實TGF-β1促進胰腺癌PANC1細胞發生EMT及侵襲[5]。在含有活化KrasG12D等位基因的胰腺癌小鼠的體內實驗研究中發現靶向抑制TGF-β信號通路下游分子可消除EMT，癌細胞出現囊性、腺體樣分化較好的表型，且幾無轉移能力[6]。

通過建立TGF-β誘導EMT相關轉錄基因高表達的PANC1細胞，發現表達顯性陰性的HrasS17N突變的細胞系無EMT相關轉錄反應，而表達持續活化的KrasG12V突變的細胞EMT相關基因表達增加[7]。利用特異性MEK1抑制劑PD98059(特異性抑制細胞外信號調節激酶ERK-1和-2的活性)干預PANC1、Colo-357和IMIM-PC1細胞系，發現細胞運動、侵襲能力增加并伴隨中度持續性ERK2活化。上述發現提示Kras介導活化MEK-ERK信號途徑在TGF-β誘導的胰腺癌EMT中起著重要作用。

Gordon等[8]研究發現，胰腺癌細胞發生EMT過程中伴隨Ⅲ型TGF-β受體(TβRⅢ)下調，提示TβRⅢ對EMT起負調節作用。作者發現TβRⅢ缺失是TGF-β誘導EMT發生的必要因素，TβRⅢ表達缺失可能是胰腺癌細胞發生EMT的關鍵事件。

2．HGF：HGF是c-Met原癌基因跨膜酪氨酸激酶受體的配體。HGF及其受體c-Met在人類胰腺癌組織中呈高表達，且HGF可通過c-Met途徑促進胰腺癌Colo-357細胞系的侵襲[9]。穩定敲除人胰腺癌SUIT-2細胞系HGF活化抑制劑-1基因(HGF activator inhibitor-1, HAI-1)可誘導EMT，并伴隨SIP1/ZEB2(Smad-interacting protein 1，Smad相互作用蛋白1)表達增加，E-鈣黏素表達下調；相反HAI-1過表達則可增加E-鈣黏素的表達并恢復上皮表型[10]。

c-Met相關酪氨酸激酶受體RON/MSTR1在93%人類胰腺癌組織中呈高表達，且在所有人類胰腺癌細胞系中均有表達[11]。體外研究[11]用RON配體MSP/MST1(巨噬細胞刺激蛋白macrophage stimulating protein)處理胰腺癌L3.6pl細胞，可使該細胞發生EMT，伴隨ERK磷酸化增加、E-鈣黏素表達下降、β-catenin核內轉位、細胞侵襲運動能力增加等。相反，同時應用RON單克隆抗體孵育，則可抑制L3.6pl細胞的運動和侵襲。在裸鼠體內實驗應用RON單克隆抗體可顯著抑制皮下及原位腫瘤的生長。因此RON和c-Met均可作為HGF誘發胰腺癌細胞侵襲的潛在治療靶點。

3．BMPs：BMP家族中，BMP-2、BMP-4和BMP-7可以誘發PANC1細胞的EMT，如下調E-鈣黏素、增強細胞運動和侵襲能力等，其提高侵襲能力的作用機制可能是由于增強了基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)的表達和活性[12]。BMP可下調胰腺癌進展過程中TβRⅢ的表達，該過程需要Smad1參與[12]。BMP4可誘導同源框基因MSX2的表達，后者與胰腺癌的EMT相關，滅活MSX2基因則可抵消BMP誘發的EMT，因此BMP4可通過誘導MSX2基因引起EMT改變從而促進胰腺癌的進展。

4．VEGF：VEGF-α和VEGF-β通過結合受體VEGFR1促進細胞運動、侵襲及EMT。用VEGF蛋白處理L3.6pl細胞，后者呈紡錘形改變，并失去細胞極性，出現偽足[13]。VEGFR1交聯可促進E-鈣黏素及β-catenin分別向細胞質及細胞核轉移。激活VEGFR1可下調E-鈣黏素和盤狀球蛋白(plakoglobin)的表達，并上調間質標志物如波動蛋白、N-鈣黏素以及EMT相關轉錄因子Snail、Twist和Slug等的表達。

三、EMT相關信號轉導通路

1．SMAD/STAT3通路：到目前為止，Smad通路是研究最為透徹的TGF-β下游信號通路。Smad蛋白超家族由受體調節Smad1～7組成。TGF-β與受體結合后，Smad 2和Smad 3通過其C末端SSXS模體磷酸化而活化，進而與Smad 4形成同型及異型復合物轉移進入細胞核而調節目的基因的轉錄。滅活編碼Smad4蛋白的DPC4基因可抑制TGF-β介導的EMT，進一步抑制KrasG12DInk4aKO鼠胰腺癌細胞的侵襲和轉移[14]，并出現上皮形態和結構、上皮標志物細胞角蛋白-19的持續表達及間質標志物波動蛋白的下調等。

Zhao等[15]研究發現，STAT3是胰腺癌EMT的必要因子，Smad4對STAT3誘發EMT起負調節作用。敲除Smad4則可致STAT3的異常激活，使TGF-β促腫瘤通路占優勢[15]。與STAT3在胰腺癌EMT中的關鍵作用一致，其下游因子LIV-1可調節EMT關鍵因子Snail的核轉位。敲除LIV-1的PANC1細胞Snail核轉移減少、E-鈣黏素上調，且細胞運動和增殖能力下降，裸鼠成瘤實驗發現腫瘤生長及轉移能力下降。

2．Ras/ERK1/2通路：K-ras突變在人類胰腺癌中廣泛存在。利用胰腺特異性彈性酶-1和Pdx1啟動子將等位基因K-rasG12D轉入小鼠胰腺，小鼠發生胰腺導管內瘤性病變(pancreatic intraductal neoplastic lesions，PanINs)，其中25%進展為侵襲性胰腺癌。導入Pdx1-KrasG12D等位基因同時敲除p53或者p16/p19Ink4a可致其充分癌變，并100%具有侵襲性，動物模型在12周內死亡[14]。研究還發現RasG12V或ERK2的過表達可致MCF-10A乳腺癌細胞發生EMT[16]，用shRNA敲除ERK2后可抵消RasG12V誘導的EMT，提示兩者之間存在相互作用。在胰腺癌中ERK的活化與EMT呈正相關，且與患者的預后相關。BMP4誘導MSX2同源框基因依賴于ERK和p38 MAPK通路的激活以及Smad蛋白的表達[17]。

3．轉錄因子：SNAI1/Snail、SNAI2/Slug、ZEB1/δEF1/ZFHX1A、ZEB2/SIP1/ZFHX1B、TWIST1/TWIST以及TWIST2/DERMO1均是EMT的重要調控因子，主要通過抑制CDH1/E-鈣黏素來促進腫瘤相關的EMT，其次尚可調節一些上皮細胞相關基因的表達，如Claudins、Cytokeratins、Cadherins、Occluding以及ZO蛋白等[18]。

Snail是一種含有鋅指結構的DNA結合蛋白，與SIP1競爭性結合E-鈣黏素啟動子部位的E-box連接基序，抑制基因的表達，促進波形蛋白(Vimentin)表達上升，引起上皮細胞向間質細胞表型轉變[19]。在MDCK(madin-darby canine kidney) 上皮細胞中，Snail與E-鈣黏素的表達呈負相關，缺乏E-鈣黏素的癌細胞出現大量的Snail，將Snail轉染至E-鈣黏素陽性的細胞可以導致細胞E-鈣黏素表達水平的下降，并表達出波形纖維蛋白等間質標記物，從而導致細胞EMT的發生[2]。Snail調節的靶基因數目眾多、功能廣泛，被稱為細胞EMT的“開關”。

Slug和Snail同屬于鋅指蛋白Snail超家族，在雞原腸胚形成過程中，Slug也可以下調E-鈣黏素的表達[1]。

四、微環境與細胞外基質

上皮細胞從同類細胞之間以及基底膜上的解離與周圍基質的重構關系密切。細胞外基質(extracelluar matrix, ECM)在細胞轉移過程中起重要作用，間質表型更易與細胞外基質發生黏附。細胞外基質及其相關酶類的改變，可以導致細胞增殖、外形改變并獲得轉移能力。由于ECM是間充質細胞分泌的，因此，上皮細胞分泌ECM可以看作其向間質細胞轉化的一個證據。同時，發生EMT改變的細胞會分泌大量的ECM及其酶類，這可促使其從原位逸出。

MMPs是一類鋅肽酶超家族，具有降解ECM成分的能力，是目前已知唯一能降解膠原纖維的酶類。膠原蛋白、層黏連蛋白、纖維連接蛋白等都是它的作用底物。腫瘤細胞本身表達MMPs的同時還能直接刺激宿主成纖維細胞大量表達MMPs。在胰腺癌PANC1細胞中研究發現，BMP可通過MMP-2促進細胞EMT，增加侵襲能力[20]。

五、MicroRNA

MicroRNAs(miRNAs)是一種大小約18～24個堿基的非編碼單鏈小分子RNA，在轉錄后水平調控基因表達。主要通過與mRNA 3′非翻譯區域配對，抑制翻譯和(或)促進降解。miRNAs在細胞增殖、分化、凋亡、基因調控及疾病的發生中扮演重要的角色。

最先在MDCK細胞中，發現miRNAs在EMT用TGF-β誘導或者蛋白酪氨酸磷酸酶Pez過表達引起的EMT中起調節作用[21]。EMT與miR-200、miR-205表達下調有關。miR-200b、200a、429的持續表達可以完全阻止TGF-β誘導的MDCK細胞發生EMT。此外，多項研究[21-22]顯示，miR-200家族(如miR-141、miR-200c)可顯著下調TGF-β對EMT的作用，miR-200直接作用于(抑制)ZEB1及SIP1的mRNA，上調胰腺癌細胞系中E-鈣黏素的表達，抑制EMT的發生。Brabletz等發現在胰腺癌細胞EMT中，ZEB1可下調miR-200家族成員miR-141和miR-200c的表達，而ZEB1和TGF-β又是miR-200家族的靶基因，提示它們之間存在負調節反饋環。

其他的一些miRNA如miRNA-10b可以上調HOXD10基因的翻譯、下調RhoC的表達，從而促進腫瘤的侵襲和轉移，而Twist可以促進miRNA-10b的轉錄[23]。另外在人類皮膚癌角化細胞中發現了一種EMT特異性miRNA：miR-21。目前認為miR-21是一種腫瘤基因，可以抑制原肌球蛋白1(tropomyosin 1，TPM1)和程序性死亡4基因( PDCD4)兩種抑癌基因的表達，從而抑制細胞凋亡。

綜上所述，EMT在胰腺癌的發生、發展中起著關鍵的作用，與多種蛋白分子、微環境及miRNA等相關，并涉及到多個信號轉導通路和復雜的分子機制。近年研究表明，吉西他濱、5-氟尿嘧啶和順鉑的耐藥與胰腺癌細胞的間質細胞表型相關[22]，并與調節因子ZEB1和Notch-2等調節因子相關。研究胰腺癌的EMT有可能為胰腺癌的輔助治療提供潛在的藥物靶點。

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2012-08-06)

(本文編輯：屠振興)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.02.020

國家自然科學基金資助項目(81172184)

100034 北京，北京大學第一醫院外科(常志剛、田孝東、楊尹默)；衛生部北京醫院外科(常志剛)

楊尹默，Email:yangyinmo@263.net