2，4-D、NAA對甘蔗胚性愈傷組織形成及分化的影響

姚麗，曾千春，楊昆，趙培方，吳才文

（1.云南省甘蔗遺傳改良重點實驗室/云南省農業科學院甘蔗研究所,開遠661600；2.云南農業大學農學與生物技術學院,昆明650201）

2，4-D、NAA對甘蔗胚性愈傷組織形成及分化的影響

姚麗1，曾千春2，楊昆1，趙培方1，吳才文1

（1.云南省甘蔗遺傳改良重點實驗室/云南省農業科學院甘蔗研究所,開遠661600；2.云南農業大學農學與生物技術學院,昆明650201）

以新臺糖22（ROC22）、福農94-0403、云蔗03-258及P44為材料，MS為基本培養基，研究切割厚薄不同的外植體及2，4-D濃度對甘蔗愈傷組織誘導的影響，R1、R2及R3三種不同培養基對分化不定芽的影響。結果表明：①外植體切片0.1cm時的誘導率較切段0.5cm高；②切片時最適2，4-D濃度為1～2mg/L，而切段時則以3mg/L時誘導率達最大；③R2和R3分化效果優于R1，R3分化培養基：MS+6-BA 1mg/L+NAA 1mg/L對愈傷組織分化不定芽的效果最佳。

甘蔗；組織培養；2，4-D；NAA

甘蔗（Saccharum spp.）是重要的糖料和能源作物。蔗糖約占世界食糖總產量的70%～80%,而在我國達90%以上[1]。甘蔗是無性繁殖作物,用種量大、繁殖倍數低,通過組織培養快繁技術能加快品種繁殖及推廣速度。甘蔗也是第一個獲得組織培養成功的禾本科植物,自1969年Babar和Nickell在斐濟突破從甘蔗組織培養物中實現植株再生距今已有四十多年[2],甘蔗組織培養技術已廣泛應用于健康種苗快繁及甘蔗遺傳轉化領域[3-6]。但是,對于遺傳基礎復雜的甘蔗而言,甘蔗愈傷組織的誘導、增殖和分化能力等組織培養特性受遺傳調控,不同基因型再生效率存在較大差異[7-9]。而甘蔗胚性愈傷組織是良種快繁及遺傳轉化的關鍵及基礎。因此,獲得高質量的胚性愈傷組織,并使之大量分化成芽對健康種苗快繁及甘蔗基因工程育種具有深遠意義。但是,大量甘蔗組織培養需要大量甘蔗莖梢之間的矛盾日益嚴重。傳統大部分研究者把外植體切成0.25～0.5cm長的段來誘導[7-11],但是該法較浪費材料,也有把外植體切成0.1cm厚的小圓片來誘導[3,12-13]。但是這兩種外植體類型所需的2,4-D濃度是否存在差異,它們之間有什么相關性未見報道。

筆者選用大面積種植的生產品種及潛力甘蔗品種作為研究材料,比較切割厚薄不同的外植體及不同2,4-D濃度對甘蔗愈傷組織誘導的影響,并添加不同濃度的6-BA、KT及NAA,比較不同激素組合對分化不定芽的影響,為今后甘蔗健康種苗快繁及遺傳轉化研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1植物材料

以新臺糖22（ROC22）、福農94-0403、P44及云蔗03-258為研究材料。其中,ROC22為全國主栽品種, P44、福農94-0403及云蔗03-258為糖能兼用品種。

1.2方法

1.2.1 愈傷組織誘導取ROC22、P44、福農94-0403及云蔗03-258甘蔗幼嫩葉鞘未成熟心葉為外植體, 75%酒精擦拭表面切取片（0.1cm）、段（0.5cm）兩種類型,接種到MS培養基,25℃暗培養,誘導胚性愈傷組織產生。誘導愈傷時2,4-D濃度設1、2、3、4mg/L 4個梯度,每處理30個切段或切片,每處理3次重復。誘導率（%）=出愈傷組織總塊數/接入外植體總塊數×100。

1.2.2 分化培養基比較以ROC22、94-0403為材料,比較R1、R2及R3三種分化培養基,R1：MS+6-BA 2mg/L+KT 1.5mg/L；R2：MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.1mg/L；R3：MS+6-BA 1mg/L+NAA 1mg/L。蔗糖：30 g/L,瓊脂：7 g/L；pH=5.8。每處理30塊愈傷組織,3次重復,培養30d后觀察統計,比較R1、R2及R3三種分化培養基分化芽數及生長情況。分化率（%）=分化出芽總塊數/接入愈傷組織總塊數×100。

1.2.3 數據處理運用SPSS13.0專業版分析軟件進行方差分析,新復極差多重比較。

2 結果與分析

2.1影響愈傷組織誘導率的因素

愈傷組織誘導效果受切片與切段的影響,且品種間出現明顯差異。厚薄不同的外植體類型及2,4-D濃度對甘蔗愈傷組織誘導率的影響,結果詳見表1。

由表1可以看出,切片時ROC22、P44在2,4-D質量濃度為1mg/L時誘導率達最大值,分別是100%、92.86%,福農94-0403、云蔗03-258則在2,4-D濃度為2mg/L時誘導率達最大值,分別是100%、72.22%；而切段時,除福農94-0403在2,4-D質量濃度為2mg/L時誘導率達最大值外,ROC22、P44及云蔗03-258都在2,4-D濃度為3mg/L時誘導率達最大值,分別是90.91%、88.24%及76.00%。因此,切片時2,4-D的最佳濃度為1～2mg/L,而切段時最佳濃度則是3mg/L。

不同品種間誘導率有差異,平均誘導率由大到小的順序是：福農94-0403＞P44＞ROC22＞云蔗03-258。除云蔗03-258外,切片時誘導率平均值皆在80%以上,而切段時誘導率平均值僅在70%左右。且經觀察發現,切片時從第3d開始陸續在切口處出現細胞膨大體,而切段則要10d左右。因此,切片誘導較切段誘導更易在較短時間內出現胚性愈傷組織?？傊?外植體切片誘導效果更好,2,4-D的最佳濃度為1～2mg/L。

2.2分化培養基的比較

愈傷組織分化效果受培養基和品種的影響,分化結果表現出明顯的差異。以ROC22、福農94-0403為材料,在R1、R2及R3三種分化培養基中培養30d后觀察統計,計算分化率,結果詳見表2。

由表2可看出,校正模型（Corrected Model）是“品種”、“培養基”及“品種×培養基”對應值之和,F= 42.465,P=0.000＜0.01,差異極顯著,表明所用模型有統計學意義。品種的F=136.743,P=0.000＜0.01,差異極顯著；培養基的F=32.323,P=0.000＜0.01,差異極顯著；品種與培養基互作的F=5.469,P=0.021＜0.01,差異顯著。這說明不同品種和不同培養基對甘蔗的分化率均有極顯著影響,且影響次序為品種＞培養基＞品種與培養基的互作。

由表3多重比較分析可知,愈傷組織在3種培養基中均能分化不定芽,但不同品種分化芽數差異較大。對于ROC22而言,培養基對分化率的影響依次是R3＞R1＞R2,但差異不顯著；而對于福農94-0403,培養基對分化率的影響依次是R3＞R2＞R1,且差異極顯著。2個甘蔗品種均以添加NAA的R3分化效果最好,添加KT的R1效果較差,尤以褐化嚴重的品種福農94-0403最為明顯（圖1）。說明6-BA+KT組合褐變較6-BA+NAA組合嚴重。此外,在相同激素組合與相同濃度下,ROC22的分化率均高于福農94-0403,說明分化率受品種遺傳特性影響?？傊?R3培養基為試驗品種的最佳分化培養基。

表1 不同2,4-D濃度誘導率（%）的比較

表2 不同甘蔗品種、分化培養基對分化率的方差分析

表3 不同甘蔗品種、分化培養基的分化率(%)

圖1 不同分化培養基的比較

3 討論

3.1外植體類型及2，4-D濃度是影響甘蔗愈傷組織誘導率的重要因素

2,4-D是誘導甘蔗愈傷組織不可缺少的生長物質[14-16]。本研究比較了切割厚薄不同的兩種外植體的誘導率,筆者發現,2,4-D使用濃度不僅因不同基因型而存在差異,而且外植體的厚薄也能影響誘導率,且外植體厚薄不同、使用的2,4-D濃度也隨之不同。研究結果表明,外植體切成0.1cm厚的小圓片時,2,4-D濃度為1～2mg/L時誘導率達最大值,而切段則在3 mg/L時誘導率達最大。這可能是因為在相同大小的直徑下,外植體切成0.1cm的片比切成0.5cm的段更接近培養基、體積更小、消耗更少,因此需要的2,4-D也較少。另外,筆者還發現,用0.1cm厚的小圓片不僅節約了材料及成本,而且誘導時間也較短、質量也較好。因此,供試品種以外植體切片、2,4-D濃度為1～2mg/L誘導愈傷組織效果最好。

3.2 NAA對甘蔗愈傷組織分化出苗的影響

不同激素混合使用更有利于降低分化苗的變異率[17]。曾東火等[10]認為細胞分裂素（KT、6-BA）與生長素（NAA、IBA）混合使用分化率高、苗多,而細胞分裂素則KT優于6-BA。但何明等（1988）[18]報道KT對于甘蔗幾乎沒有什么效果。而生長素則以NAA較好,因為NAA不僅有促進生根的作用,對于禾本科及某些單子葉植物而言,也有利于分化的作用[19]。賢武等（2000）[20]研究也表明,6-BA+KT組合褐變最嚴重,最輕的是6-BA和6-BA+NAA,且濃度越低褐變越輕。本研究試驗也表明,6-BA+KT組合的R1褐變最嚴重,6-BA+NAA組合的R2次之、R3最輕,特別是褐化較嚴重的福農94-0403更明顯。這可能是因為細胞分裂素類物質有刺激和增進甘蔗多酚氧化酶活性的作用,因而增加“酚-醌”類物質對細胞的毒害,這就解釋了為什么含細胞分裂素相對較多的分化培養基褐化最嚴重,分化效果最差。研究結果表明：R3分化培養基對供試品種愈傷組織分化不定芽的效果最佳。

[1]李楊瑞.現代甘蔗學[M].北京：中國農業出版社,2010.

[2]Barba R,Nickell L G.Nutrition and organ differentination in tissue culture of sugarcane a monocotyledon[J].Planta（Berl）, 1969,89（3）：299-302.

[3]梁巧玲,趙鸝.甘蔗愈傷組織誘導與植株再生研究[J].安徽農業科學,2007,35（32）：10246-10247.

[4]唐紅琴,方鋒學,韋金菊,等.甘蔗莖尖脫毒組織培養技術研究進展[J].南方農業學報2011,42（8）：860-865.

[5]劉洪博,姚麗,蘇火生,等.轉甘蔗抗蟲基因Cp TI的RT-PCR檢測[J].中國糖料,2011（1）：11-12.

[6]黃東杰,孫繼華.甘蔗育種研究進展[J].熱帶農業科學,2012,32（1）：16-49,53.

[7]譚志勇,譚中文,張志勝.不同基因型甘蔗組織培養特性的研究[J].廣東農業科學,2005（1）：34-36.

[8]梁計南,譚中文,譚志勇,等.甘蔗不同基因型組織培養特性的研究[J].華南農業大學學報（自然科學版）,2002,10（4）：37-40.

[9]岑秀芬,楊燕妮,韋鵬霄,等.激素因子對甘蔗愈傷組織誘導增殖與分化的效應[J].廣西農業科學,2010,41（9）：889-892.

[10]曾東火,林妙英,韓延南,等.甘蔗組織培養技術的研究[J].福建農業科技,1983（4）：11-14,6.

[11]秦廷豪,鄒宗蘭,吳才文.甘蔗愈傷組織塊幼小植株的分化甘蔗[J].甘蔗,2000,7（3）：29-31.

[12]羅素蘭,陳如凱,黎仁艾.甘蔗組織培養中培養基的優化[J].海南大學學報自然科學版,2002,20（2）：120-124.

[13]黃誠梅,李楊瑞,葉燕萍.甘蔗組織培養與快速繁殖[J].作物雜志,2005（4）：25-26.

[14]盧萍.甘蔗胚狀體的誘導與植株再生[J].貴州農業科學,1991（2）：9-12.

[15]湯浩,王子琳,李海明,等.果蔗組織培養快繁技術研究[J].福建農業學報,2001（4）：3-5.

[16]崔凱榮,邢更生,周功克,等.植物激素對體細胞胚胎發生的誘導與調節[J].遺傳,2000,22（5）：349-354.

[17]陳彪,梁鉀賢,陳偉棟,等.甘蔗組織培養配方中不同激素效應的研究[J].華南農業大學學報,2000,21（1）：60-62.

[18]何明.甘蔗組織培養技術的研究[J].四川甘蔗,1988（1）：29-33.

[19]李富生,楊生超,楊清輝,等.植物組織培養與甘蔗腋芽快繁[M].昆明：云南科技出版社,2002.

[20]賢武,王倫旺,王天算,等.甘蔗莖尖脫毒培養研究初報[J].廣西蔗糖,2000（4）：3-5.

Effects of 2,4-D and NAA on Embryogenic Callus Formation and Shoot Regeneration of Sugercane（Saccharum spp.）

YAO Li1,ZENG Qian-chun2,YANG Kun1,ZHAO Pei-fang1,WU Cai-wen1
（1.Yunnan Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement/Sugarcane Research Institute,Yunnan Academy of Agricultural Sciences,Kaiyuan 661600,China;2.College of Agronomy and Biotechnology,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201, China）

Explants of sugarcane varieties ROC22,Funong 94-0403,Yunzhe 03-358 and P44 were cultured on MS medium with various supplements.Experiments were executed to evaluate the effect of different thickness of explants and different concentration of 2,4-D on callus induction as well as three different medium of R1,R2, R3 on shoot regeneration.The results were as the following:firstly,the induction rate of explants of 0.1 cm thick discs was higher than that of 0.5 cm thick segments;secondly,the appropriate 2,4-D concentration for callus induction were 1-2 mg/L for explants of 0.1 cm thick and 3 mg/L for explants of 0.5 cm thick;thirdly,shoot regeneration rating ofthe R2 and R3 were better than thatofthe R1,and the R3 medium:MS supplemented with NAA at 1 mg/L and 6-BA at1 mg/L was the bestmedium for shootregeneration.

sugarcane;tissue culture;explantthickness;2,4-D;NAA

S566.1；Q78

：A

1007-2624（2013）02-0008-03

2013-01-27

國家現代農業產業技術體系建設專項資金（CARS-20-1-1）。

姚麗（1984-）,女,云南省金平縣人,碩士,研究實習員,主要從事甘蔗遺傳育種研究。

吳才文,研究員,主要從事甘蔗遺傳育種研究。E-mail：gksky_wcw@163.com