旋覆花素對AD模型大鼠腦海馬組織PPARγ表達的影響

王英杰，王文勝，耿淑坤，柴錫慶，3*

（1.河北省邯鄲市第一醫院神經內科，河北邯鄲056002；2.河北醫科大學基礎醫學研究所，省部共建教育部重點實驗室，河北石家莊050017；3.河北化工醫藥職業技術學院新藥研發基地，河北石家莊050026）

·論 著·

旋覆花素對AD模型大鼠腦海馬組織PPARγ表達的影響

王英杰1，2，王文勝2，耿淑坤1，柴錫慶2，3*

（1.河北省邯鄲市第一醫院神經內科，河北邯鄲056002；2.河北醫科大學基礎醫學研究所，省部共建教育部重點實驗室，河北石家莊050017；3.河北化工醫藥職業技術學院新藥研發基地，河北石家莊050026）

目的 觀察旋覆花素對β淀粉樣蛋白25～35片段（β-Amyloid protein 25-35，Aβ25-35）海馬內注射致阿爾茨海默?。ˋlzheimers disease，AD）模型大鼠海馬過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferatoractivated receptorγ，PPARγ）表達的影響，探討其對AD大鼠的治療作用及機制。方法30只SD大鼠隨機分為對照組、模型組及旋覆花素給藥組，Aβ25～35海馬內注射制備AD大鼠模型，給藥組給予旋覆花素26mg·kg-1·d-1、模型組給予等量溶劑，分2次灌胃，共21d。Western Blot測定大鼠海馬PPARγ表達。結果模型組海馬PPARγ表達下降，給藥組PPARγ表達升高，與模型組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。結論旋覆花素通過上調PPARγ的表達，從而抑制Aβ誘導的AD模型大鼠腦海馬腦內炎癥反應。

阿爾茨海默??；過氧化物酶體增殖物激活受體；大鼠

過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator activatived receptors，PPARs）是由配體激活的轉錄因子，屬于核激素受體超家族，參與體內眾多生理和病理反應的調節，如糖代謝、脂肪代謝和細

胞分化等［1］。PPARs的活性降低與炎癥介質的水平上升密切相關，PPARs的抗炎效應在多種炎癥性疾病中有重要作用，對于多種人體的疾病，以PPAR作為治療靶點可以取得明顯的效果。越來越多的證據顯示阿爾茨海默?。ˋlzheimers disease，AD）的神經毒性由中樞神經系統炎癥介導［2-3］，PPARγ在腦內的表達與炎癥、神經退行性變關系正在被廣泛研究，研究［4-5］顯示PPARγ基因參與了AD的發病。本文采用免疫組織化學及Western Blot方法研究旋覆花素對核轉錄因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、PPARs激活的影響，為探明旋覆花素抑制AD腦炎癥反應提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物：健康雄性SD大鼠30只（由河北省實驗動物中心提供，動物合格證號611071），鼠齡10～12月齡，體質量（364.5±15.0）g，隨機分為對照組、模型組和旋覆花素給藥組，每組10只。給藥組術前3 d及術后每天用旋覆花素26mg·kg-1· d-1灌胃，共21d。模型組用旋覆花素的溶劑吐溫80水溶液同法處理。

1.2 試劑與儀器：旋覆花素由河北醫科大學藥學院從歐亞旋覆花的氯仿提取物中分離制備（已獲專利授權），含旋覆花內酯（1-o-acetylbritannilactone，ABL）2.66g/L。β淀粉樣蛋白25～35片段（β-Amyloid protein 25～35，Aβ25～35）購自Sigma公司；PPARγ抗體購自Santa Cruz公司；免疫組織化學試劑盒購自北京中杉金橋生物技術公司；腦立體定向儀，江灣Ⅰ型C，上海川沙花木農機廠制造。

1.3 Aβ25～35的孵育：用無菌生理鹽水將Aβ25～35稀釋成10g/L，37℃孵育72h，使其變為聚集狀態的Aβ25～35，置于在4℃冰箱備用。

1.4 藥物海馬內注射方法：大鼠用質量濃度為20g/L的烏拉坦60mg/kg腹腔注射麻醉后，固定于腦立體定向儀上。參照大鼠腦立體定位圖譜［2］，以前囟為零點，于前囟后3.5mm，中線右側旁開2mm，為穿刺點，用牙科鉆鉆開顱骨，以微量注射器自腦表面垂直進針3mm，分別于雙側海馬CA1區于5min內緩慢注射Aβ25～35各1μL（10μg），5min緩慢注入，留針5min，對照組注射等量生理鹽水，退針縫合切口。術前3d及術后18d，給藥組給予旋覆花素26mg·kg-1·d-1分2次灌胃，模型組給予等量溶劑。

1.5 免疫組織化學染色：參照使用說明書進行經過乙醇梯度脫水、石蠟垂直包埋，間斷均勻切片，切片厚約10μm，采用鏈霉親和素-生物素復合素（strept advin-biotin complex，SABC）方法進行免疫組織化學染色。以抗PPARγ（1∶100）抗體為一抗，其他操作按試劑盒說明書進行。以鏡下出現棕黃色顆粒作為判定陽性染色的標準。用磷酸鹽緩沖液替代一抗作為陰性對照。

1.6 Western Blot分析：各組取等量蛋白提取液80μg，經12％聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electroresis，SDS-PAGE）電泳分離后，于半干轉膜儀上轉移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF），用5％脫脂奶粉封閉，與抗PPARγ抗體（1∶300）在4℃條件下反應過夜。然后與HRP標記的相應二抗（1∶10 000）室溫反應2h，室溫條件下用TTBS、TBS充分振蕩洗膜后采用化學發光法顯影。用美國Kodak公司ID數碼成像分析系統分析結果。

1.7 統計學方法：應用SPSS 13.0統計軟件包處理數據，計量資料以±s表示，采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

免疫組織化學染色結果顯示，模型組大鼠腦海馬組織中PPARγ表達較對照組明顯下降，染色細胞數量少，著色淺。旋覆花素給藥組大鼠腦海馬組織PPARγ的表達明顯較模型組增強，染色細胞數量多，著色變深（圖1）。

Western Blot顯示，對照組大鼠腦海馬組織PPARγ表達量高，模型組海馬組織表達量顯著降低，旋覆花素給藥組大鼠腦海馬組織PPARγ表達量明顯上調，與模型組比較差異有統計學意義（P＜0.05）（圖2）。

圖1 大鼠海馬CA1區PPARγ表達免疫組織化學染色（×400）A.對照組；B.模型組；C.給藥組

圖2 Western Blot檢測海馬組織PPARγ表達

3 討 論

PPAR在AD中發揮多種作用，其中抗炎效應是其重要的一方面。Sung等［6］研究發現，PPARγ合成配體噻唑烷二酮類藥物（thiazolidinediones，TZDs）2，4-TZD可以減少p65核移位，降低NF-κB的結合能力，說明PPAR通過抑制NF-κB途徑發揮其抗炎效應。PPAR激動劑可以抑制Aβ25～35介導的小膠質細胞的活化，從而阻止皮質和海馬神經元死亡，PPARγ激動劑可以治療AD、帕金森病等神經變性?。?-9］。Sastre等［10］研究表明，與健康人比較AD患者前腦PPAR蛋白水平降低40％，并且與β位點APP內切酶1（beta-site amyloid precursor protein cleavage 1，BACE1）啟動子的過氧化物酶體增殖物反應元件結合能力下降50％，這導致了BACE1的活化，Aβ25～35產生增多，加重AD腦的慢性炎癥。PPARγ已成為合成治療AD藥物的有效靶點。

歐亞旋覆花性味咸、溫，屬菊科旋覆花屬植物，是一種傳統的中草藥，具有活血化瘀、抗炎止痛之功效。旋覆花素的抗炎機制與抑制NF-κB活化、下調其下游基因環氧化酶2和誘導型一氧化碳合酶表達有關。本文中模型組大鼠海馬內PPAR基因表達顯著低于對照組，說明Aβ25～35海馬內注射可抑制海馬組織PPAR基因的表達。

給予旋覆花素治療后，大鼠腦海馬組織內PPAR基因表達明顯上調，表明旋覆花素能夠促進Aβ海馬內注射誘發的AD模型大鼠PPAR基因的表達。

綜上所述，旋覆花素能上調PPAR基因表達，從而抑制NF-κB表達，抑制其下游炎癥因子，減輕Aβ25～35海馬內注射引起的腦內炎癥反應，減輕神經元的損傷。

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（本文編輯：趙麗潔）

R743.9

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1007-3205（2013）07-0802-03

2012-11-08；

2013-03-05

王英杰（1973-）男，河北邯鄲人，河北省邯鄲市第一醫院副主任醫師，醫學博士，從事老年癡呆疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail：xqchai@163.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.07.021