14種中成藥微生物限度檢查方法研究

黃英

（麗江市食品藥品檢驗所，云南麗江674100）

14種中成藥微生物限度檢查方法研究

黃英

（麗江市食品藥品檢驗所，云南麗江674100）

目的：建立14種中成藥的微生物限度檢查方法。方法：按照《中國藥典》（2010年版）微生物限度檢查法的規定，采用常規法、培養基稀釋法及薄膜過濾法對各品種細菌、霉菌和酵母菌數進行回收率測定，通過回收率試驗測定藥物的抑菌性；采用直接接種法對各品種控制菌進行測定。結果：6種供試品（抗宮炎片、克咳膠囊、保濟丸、夏桑菊顆粒、婦炎康復膠囊、小兒咽扁顆粒）無抑菌作用，細菌回收率均大于70%，可采用常規法對細菌數測定；4種供試品（藿香清胃片、護肝寧片、橘紅丸、黃芩片）對細菌抑菌作用較強，可采用培養基稀釋法（0.2 mL/皿）進行細菌數測定；4種供試品（清熱解毒片、鼻淵丸、冠心丹參膠囊、清喉利咽顆粒）對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有很強的抑菌作用，需采用薄膜過濾法測定細菌數；上述各品種的霉菌和酵母菌及各種必檢控制菌均可采用常規法檢查。結論：經驗證的微生物限度檢查方法適用于以上中成藥的微生物限度檢查，可有效控制其質量。

中成藥；微生物限度檢查；方法驗證

中成藥雖不像抗生素有明顯的抗菌譜，但對不同菌種其抑菌作用不同。為保證微生物限度檢查法的準確性，根據《中國藥典》（2010年版）一部附錄的規定，在進行藥品的微生物限度檢查時，必須采用方法學驗證試驗說明方法的有效性[1]?，F行《中國藥典》收載的各中成藥品種檢查項下，很少規定具體的微生物限度檢查方法，為確保用藥的安全與有效，本研究按《中國藥典》（2010年版）、《中國藥品檢驗標準操作規范》[2]、《藥品微生物學檢驗技術》[3]及有關文獻[4-11]，探索并建立藿香清胃片等14種中成藥的微生物限度檢查方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

HTY-2000（A）型集菌儀，杭州高得醫療器械有限公司；GSP-9270MBE隔水式電熱恒溫培養箱，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；SPX-150生化培養箱，上海金慧科電子有限公司；LDZM-6KCS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠。

1.2 菌種

枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]均由云南省食品藥品檢驗所提供。

1.3 培養基

營養瓊脂（批號 101104）、玫瑰紅鈉瓊脂（批號 1102232）、營養肉湯（批號 101124）、改良馬丁瓊脂（批號 101104）、麥康凱瓊脂（批號 101018）、膽鹽乳糖（批號 1012012）、乳糖膽鹽發酵培養基（批號080214）均為北京三藥科技開發公司產品。按規定進行的適用性檢查結果合格。稀釋劑為pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液。

1.4 樣品

藿香清胃片（吉林省俊宏藥業有限公司，薄膜衣0.31 g/片）；護肝寧片（通化斯威藥業股份有限公司，0.3 g/片）；橘紅丸（云南騰藥制藥股份有限公司，6 g/丸）；黃芩片（葵花藥業集團（佳木斯）有限公司，0.26 g/片）；清熱解毒片（陜西盤龍制藥集團有限公司，糖衣片）；鼻淵丸（李時珍醫藥集團有限公司，每10粒重2 g）；冠心丹參膠囊（長春遠大國奧制藥有限公司，0.3 g/粒）；清喉利咽顆粒（桂龍藥業（安徽）有限公司，5 g/袋）；抗宮炎片（江西天施康中藥股份有限公司，0.25 g/片）；克咳膠囊（貴州益佰制藥股份有限公司，0.3 g/粒）；保濟丸（廣州王老吉藥業股份有限公司，3.7 g/粒）；夏桑菊顆粒（四川蜀中制藥有限公司，10 g/袋）；婦炎康復膠囊（江西杏林白馬藥業有限公司，0.38 g/粒）；小兒咽扁顆粒（黃石三九藥業有限公司，8 g/袋）。

2 方法與結果

按《中國藥典》（2010年版）一部附錄微生物限度檢查法進行驗證。

2.1 菌液制備

2.1.1 金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌取經30～35℃培養18～24 h的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌的營養肉湯培養物1mL，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍遞增稀釋至10-5～10-7，使成50～100 cfu/mL，經活菌計數后備用。

2.1.2 白色念珠菌 取經23～28℃ 培養24～48 h的白色念珠菌的改良馬丁液體培養物1 mL，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍遞增稀釋至10-5～10-6，使成50～100 cfu/mL，經活菌計數后備用。

2.1.3 黑曲霉 取經23～28℃培養1周的黑曲霉改良馬丁瓊脂斜面培養物，用5 mL含0.05%（V/V）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液洗下黑曲霉孢子，吸出孢子懸液 1 mL至無菌試管內，用含0.05%（V/V）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 mL含孢子數50～100 cfu的孢子懸液。

2.2 供試液制備

稱樣品10 g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，搖勻，得1∶10供試液。

2.3 驗證試驗

細菌、霉菌與酵母菌計數方法的驗證，若試驗組的菌回收率均不低于70%，可按該供試液制備方法和計數方法測定供試品的細菌、霉菌與酵母菌數；若任一次平行試驗中試驗組的菌回收率低于70%，應建立新的方法，并重新驗證。

2.3.1 常規法 取供試液（1∶10）1 mL入皿，然后每皿加營養瓊脂或玫瑰紅鈉瓊脂培養基15～20 mL，搖勻，按《中國藥典》（2010年版）一部附錄微生物限度檢驗方法進行。用常規法測定各品種對5株試驗菌的回收率，以確定其抑菌程度，結果見表1。

表1 14種中成藥常規法（1 mL/皿）不同試驗菌回收率（%）

由表 1可知，抗宮炎片、克咳膠囊、保濟丸、夏桑菊顆粒、婦炎康復膠囊、小兒咽扁顆粒6個品種對5株試驗菌的回收率均高于 70%，證明無抑菌作用。藿香清胃片、護肝寧片、橘紅丸、黃芩片4個品種對金黃色葡萄球菌或枯草芽孢桿菌有一定的抑菌作用；清熱解毒片、鼻淵丸、冠心丹參膠囊、清喉利咽顆粒抑菌作用很強，改用培養基稀釋法或薄膜過濾法重新驗證。各品種對大腸埃希菌、白色念珠菌及黑曲霉均無抑制作用，回收率均達到70%以上，可采用常規法測定。

2.3.2 培養基稀釋法 取上述供試液（1∶10）1 mL，注入5個平皿中（每平皿0.2 mL），然后每皿加營養瓊脂培養基15～20 mL，搖勻，按《中國藥典》（2010年版）一部附錄微生物限度檢驗方法進行。用培養基稀釋法測定上述有抑菌作用品種對各抑菌菌株的回收率，結果見表2?？芍?，經培養基稀釋（每平皿0.2 mL），藿香清胃片、護肝寧片、橘紅丸、黃芩片對金黃色葡萄球菌或枯草芽孢桿菌已無明顯抑菌能力，回收率均大于70%，而對清熱解毒片、鼻淵丸、冠心丹參膠囊、清喉利咽顆粒，由于抑菌作用很強，采用培養基稀釋法（0.2 mL/皿）不能完全消除其抑菌作用。

表2 培養基稀釋法（0.2 mL/皿）和薄膜過濾法回收率（%）

2.3.3 薄膜過濾法 取上述供試液（1∶10）1 mL，加入置有100 mL沖洗液的濾器中，經減壓抽濾干凈后，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，每次約100 mL，共沖洗400 mL/膜，在最后一次沖洗液中加入50～100 cfu。濾干后取膜，菌面向上貼于營養瓊脂平板，經35℃培養3 d后，點計菌落數。測定結果見表2。由表1、2可知，清熱解毒片、鼻淵丸、冠心丹參膠囊、清喉利咽顆粒常規法和培養基稀釋法（0.2 mL/皿）檢驗時對金黃色葡萄球菌或枯草芽孢桿菌有很強的抑菌作用，回收率低于70%，采用薄膜過濾法，回收率均大于70%，因此，薄膜過濾法可用于上述4種中成藥的細菌計數檢查。

2.4 控制菌檢查方法驗證

2.4.1 大腸埃希菌 取1∶10試驗組供試液 10 mL及1 mL（50～ 100 cfu/mL）大腸埃希菌液，加入到膽鹽乳糖增菌培養基100 mL中，依據大腸埃希菌檢查法進行試驗。

取1∶10樣品組供試液10 mL，加入到膽鹽乳糖增菌培養基100 mL中，依據大腸埃希菌檢查法進行試驗。

2.4.2 大腸菌群 取1∶10試驗組供試液1 mL及1 mL（50～100 cfu/mL）大腸埃希菌液，加入到乳糖膽鹽發酵培養基10 mL中，依據大腸菌群檢查法進行試驗。

取1∶10樣品組供試液1 mL，加入到乳糖膽鹽發酵培養基10 mL中，依據大腸菌群檢查法進行試驗。

2.4.3 本研究14個品種均為口服制劑，按《中國藥典》（2010年版）一部附錄微生物限度檢查法的規定，每 1 g不得檢出大腸埃希菌；有原藥材粉末投料的應檢大腸菌群，每1 g不得超過100個。本研究試驗組檢出試驗菌（大腸埃希菌），樣品組未檢出控制菌（大腸埃希菌、大腸菌群）。因此該試驗方法成立。

3 微生物限度檢查方法的建立

3.1 細菌計數檢查法

當大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌3種試驗菌株的回收率均達到70%以上時，說明樣品中污染的各類細菌均能順利檢出，可用該法檢查本品的細菌數。因此本研究中14個品種的細菌計數檢查法為抗宮炎片、克咳膠囊、保濟丸、夏桑菊顆粒、婦炎康復膠囊、小兒咽扁顆?？捎贸Ｒ幏z查；藿香清胃片、護肝寧片、橘紅丸、黃芩片可用培養基稀釋法（0.2 mL/皿）檢查；清熱解毒片、鼻淵丸、冠心丹參膠囊、清喉利咽顆?？捎帽∧み^濾法檢查。

3.2 霉菌和酵母菌計數檢查法

上述各品種的霉菌和酵母菌，均可用常規法檢查。

3.3 控制菌檢查法

各必檢控制菌均可用常規法檢查。

4 討論

4.1 本研究所涉及的14種中成藥進行細菌、霉菌和酵母菌計數方法驗證時，試驗菌株僅選用金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌2株菌即可，這樣即可保證檢驗方法的有效性，又節省了大量的人力和物力。

4.2 如中成藥含有較強的抑菌成分，由于抑菌成分的干擾，采用常規法進行微生物限度檢查，結果不能真實反映其污染的微生物的狀況。因此，使用適當的方法（通過對供試品作相應的處理，采取離心、培養基稀釋法、薄膜過濾法等或幾種方法聯用）消除其抑菌成分的干擾，才能提高中成藥中污染微生物的檢出率。對具有抑菌作用的中成藥，因其抑菌作用的強弱不同，進行微生物限度檢查時，要消除其抑菌活性所采用的方法也有所區別。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（2010年版）一部[S].北京：中國醫藥科技出版社，2010：附錄79-88.

[2] 中國藥品生物制品檢定所，中國藥品檢驗總所.中國藥品檢驗標準操作規范 2010年版[M].北京：中國醫藥科技出版社，2010：351-407.

[3] 蘇德模，馬緒榮.藥品微生物學檢驗技術[M].北京：華齡出版社，2007：221-227.

[4] 林麗英，湛文青，陸廣欣.銀翹解毒顆粒等中成藥微生物限度檢查法的建立[J].中成藥，2006，28（12）：1845-1847.

[5] 向東，張赟華，錢文璟.益心舒微丸微生物限度檢查法及有效性驗證試驗研究[J].藥物分析雜志，2007，27（5）：730-732.

[6] 劉鵬，馬仕洪，戴翚，等.加替沙星微生物限度檢查方法的建立[J].藥物分析雜志，2007，27（6）：881-884.

[7] 楊靜.藥品微生物限度檢查法的影響因素分析[J].中國藥事，2008，22（12）：1095-1096.

[8] 潘強.六種中藥微生物限度檢查方法驗證[J].中國藥品標準，2010，11（1）：44-47.

[9] 王翠蓉，丁艷霞.速效止瀉膠囊微生物限度檢查方法的建立和驗證[J].中國藥品標準，2010，11（1）：47-50.

[10] 宋勤，杜平華.中成藥微生物限度檢查方法的探討[J].中國藥事，2006，20（1）：46-48.

[11] 許華玉，杜蕓，錢文靜，等.藥品微生物限度檢查法中細菌和真菌計數方法的驗證試驗[J].中國中藥雜志，2005，30（24）：1918-1920.

Study on the Microbial Limit Test Method for 14 Kinds of Chinese Patent Medicines

Huang Ying
（Lijiang Institute for Food and Drug Control，Yunnan Lijiang 674100，China）

Objective：To establish a method of microbial limit test for 14 kinds of Chinese patent medicines.Methods: According to the microbial limit test method set forth in the Chinese Pharmacopoeia of 2010 edition，the conventional method，medium dilution method and membrane filtration method were used for the recovery determination of the varieties of bacteria，mould and yeast，the antibacterial property of drugs was tested through the recovery determination，and the different control bacteria were determined by the direct inoculation method.Results:Six testing samples（kanggongyan tablets，keke capsules，baoji pills，xiasangju granules，fuyankangfu capsules，and xiaoeryanbian granules）showed no bacteriostasis and their bacterial recovery rates were more than 70%，which showed that the conventional method can be used to determine the bacterial count.The testing samples of huoxiangqingwei tablets，huganning tablets，juhong pills and huangqin tablets showed strong bacteriostasis，and the culture medium dilution method （0.2 mL/plate）can be used for the bacterial count determination.The testing samples of qingre jiedu tablets，biyuan pills，guanxin danshen capsules and qinghou liyan granules presented very strong bacteriostasis on Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis，and membrane filtration method should be used for the bacterial counting test.The conventional method can be used for the testing of mould and yeast and various control bacteria of above mentioned testing samples.Conclusion:The method of microbial limit test was verified suitable for the above mentioned Chinese patent drugs and the method was proved effective in the quality control of the drugs.

Chinese Patent Medicine；Microbial Limit Test；Method Validation

10.3969/j.issn.1672-5433.2013.03.007

2012-08-31）

黃英，女，副主任藥師。研究方向：藥品檢驗。E-mail：huangyinglj11@163.com