微小RNA-187*在結直腸癌組織中表達及其對結腸癌細胞凋亡的影響

河北醫科大學第一醫院普通外科，河北 石家莊 050031

微小RNA-187*在結直腸癌組織中表達及其對結腸癌細胞凋亡的影響

劉博 田延鋒 趙增仁 樊智彬 張麗靜 賀新奇 高利飛

河北醫科大學第一醫院普通外科，河北 石家莊 050031

背景與目的：微小RNA(microRNA, miRNA)在細胞分化、細胞周期及凋亡過程中發揮重要作用。miRNA通過擴增、缺失、突變和沉默等機制影響癌癥的發生、發展。本研究探討miR-187*在結直腸癌組織中的表達和臨床意義，以及上調miR-187*表達量對結腸癌細胞凋亡的影響。方法：采用實時熒光定量反轉錄聚合酶鏈反應(real-time quantitative reverse transcription-PCR，real-time PCR)的方法在40例結直腸癌患者組織標本中檢測miR-187*的表達水平，結合病理資料分析其臨床意義。HCT116細胞轉染miR-187*mimics后，用Annexin-Ⅴ FITC/PI流式細胞術檢測miR-187*對凋亡的影響。結果：miR-187*在結直腸癌組織中表達量為0.165(0.106，0.428)，明顯低于正常黏膜組織表達量［0.334(0.211，0.712)］，差異有統計學意義(P＜0.05)，且在黏液癌及高齡患者中下調更明顯(P＜0.05)。將miR-187*mimics轉染至HCT116中可提高其表達量，通過流式技術檢測發現，與對照組早期凋亡率[(23.010±1.279)%]相比較，實驗組早期凋亡率［(26.748±1.098)%］升高，差異有統計學意義(P＜0.05)。結論：miR-187*在結直腸癌組織中低表達，并且與組織學類型及年齡有關；miR-187*表達上調可促進HCT116早期凋亡；miR-187*具有潛在抑癌作用。

結直腸腫瘤；微小RNA；microRNA-187*；凋亡

結直腸癌是常見的惡性腫瘤之一。美國全球癌癥統計分析報告顯示：結直腸癌在常見癌癥中位居前三。2008年，全球范圍內新增約1 200萬結直腸癌患者，其中60.8萬例死亡(占所有癌癥死亡人數的8%，成為第四大最常見的癌癥死亡的原因)［1］。我國農村和城市結直腸癌發病率均呈逐年升高趨勢［2］，結直腸癌的發病機制仍不明確。miRNA的出現為結直腸癌的研究提供了新的切入點。miRNAs是一類小的可調控基因表達的內源性非編碼RNA，長度為19～24 bp，廣泛存在于真核細胞生物中，主要在轉錄后水平調控基因表達功能。miRNA在腫瘤的發生、發展中所扮演的角色受到越來越多研究者的關注，結合表觀遺傳學探討其表達調節也是當前研究熱點［3］。本課題組早期利用基因芯片技術對miRNAs進行篩查發現，miR-187*在結直腸癌組織中低表達。查閱文獻發現miR-187*參與冠心?。?］、男性胸主動脈瘤［5］疾病發生、發展的調控，但對miR-187*在腫瘤中研究的文獻較少。本研究旨在探討miR-187*在結直腸癌組織中的表達、臨床意義；上調miR-187*表達量對結腸癌細胞凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 臨床標本

收集2011年5月—2012年5月河北醫科大學第一醫院、河北醫科大學第四醫院結直腸癌手術標本40例。每例標本分別取自結直腸原發腫瘤組織及上(下)切緣正常黏膜且術后病理證實無癌組織侵犯。新鮮標本離體后迅速置于液氮中，于-80 ℃保存。40例患者術前未接受任何化療和放療。

1.1.2 細胞株

結腸癌細胞株HCT116由香港中文大學消化疾病研究所于君饋贈。

1.1.3 主要試劑

McCoy’s 5A培養液、胎牛血清(FBS)、青霉素鏈霉素(PEST)均購自美國Gibco公司。胰蛋白-乙二胺四乙酸(EDTA)消化液購自北京諾博萊德科技有限公司。Annexin V-FITC試劑盒購自深圳欣博盛生物科技有限公司。miR-187* mimics和negative control轉染試劑盒購自廣州銳博生物科技有限公司。LipofectmanineTM2000及TRIzol試劑均購自美國Invitrogen公司。實時熒光定量反轉錄聚合酶鏈反應(real-time quantitative reverse transcription-PCR，real-time PCR)采用All-in-One? miRNA qRT-PCR 檢測試劑盒、內參U6、miR-187*的引物均購自廣州復能基因有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養

HCT-116細胞使用McCoy's 5A培養液，并在細胞培養液中加入10% FBS及1×PEST，在37 ℃，CO2體積分數為5%的水飽和濕度條件下培養。每1～2 d換液傳代1次。當細胞生長至106～107時收集細胞，備用提取RNA。

1.2.2 細胞轉染

轉染前1天，將適量(約4×104～5×104)細胞接種在24孔細胞培養板上，每孔加入不含抗生素的細胞培養液400 μL。密切觀察細胞生長情況，當細胞密度達到 30%～50%時，開始進行實驗組(miR-187* mimics)和對照組(negative control, NC)的轉染。用50μL的不含血清培養基Opti-MEM 對1.25 μL濃度為20 μmol/L的miR-187* mimics和negative control進行稀釋，輕輕振蕩混勻，室溫下溫育5 min。用50 μL的不含血清培養基Opti-MEM 對1 μL LipofectmanineTM2000進行稀釋，輕輕振蕩混勻，室溫下溫育5 min。將稀釋好的miR-187* mimics和negative control和LipofectmanineTM2000混合，輕柔混勻，室溫下溫育20 min，以形成混合物。100 μL混合物加到培養板的孔中，輕輕搖晃細胞培養板使其與培養液混勻。將細胞培養板置于CO2體積分數為5%的培養箱中，在37 ℃下培養4～6 h后，移除每孔中含有混合物的培養液，更換新的培養液。繼續在37 ℃、CO2體積分數為5%的條件下培養24 h后，進行轉染后的其他實驗檢測。

1.2.3 細胞凋亡檢測

取實驗組及對照組細胞數量約為106，用4 ℃無菌PBS液洗滌細胞2次，用250 μL結合緩沖液將細胞稀釋為濃度2×105～5×105/mL細胞懸浮液。取195 μL細胞懸浮液加入5 μL FITC標記的Annexin-Ⅴ，混勻后靜置3 min，然后加入10 μL濃度為20 μg/mL的PI?；靹蚝笫覝乇芄鉁赜?0 min。加入300 μL的結合緩沖液，混勻，立即進行流式細胞儀檢測。實驗重復3次，每次做3個復孔。

1.2.4 組織標本及結直腸癌細胞株中總RNA的提取

患者的組織標本或細胞標本中加入1 mL TRIzol勻漿，室溫下靜置5 min；加入0.2 mL氯仿，振蕩混勻后靜置5 min；4 ℃ 15 000×g離心15 min，吸取上層無色液相至另一管中，加入0. 5 mL異丙醇，室溫下放置15 min，4 ℃15 000 ×g離心15min，可見RNA沉淀在管底部或側壁。棄上清液，加75%乙醇1mL振蕩器混勻，4 ℃ 6 000 ×g離心5 min，棄上清液，靜置15 min后用無RNA酶水溶解混勻，分光光度計檢測RNA濃度及A260/A280的數值，且A260/A280＞1.8。

1.2.5 組織標本miR-187*表達的檢測

采用qRT-PCR檢測患者癌組織及正常黏膜組織中miRNA-187*的表達，按照All-in-One?miRNA qRT-PCR檢測試劑盒說明書操作。取2 μg總RNA反轉錄成cDNA，再以稀釋5倍cDNA為模板，qPCR擴增miR-187*及U6的基因片段。反轉錄選用25 μL反應體系：總RNA模板2 μg，2.5 U/ μL Poly A 多聚酶1 μL，逆轉錄酶混合物1 μL，5×反應緩沖液1 μL，補無DNA酶無RNA酶水至25 μL。反應條件：37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min。qRT-PCR選用20 μL反應體系：2×All-in-One qPCR Mix 10 μL，All-in-One miRNA qPCR引物(2 μmol/L) 2 μL，通用銜接頭 PCR 引物(2 μmol/L) 2 μL，第一鏈cDNA (稀釋1∶5) 2 μL，50×ROX參考染料0.4 μL，補無RNA酶的水至20 μL。反應條件：95 ℃預變性10 min，然后按95 ℃×10 s，60 ℃×30 s，72 ℃× 10 s，進行45個循環。其中細胞實驗重復3次。

1.3 統計學處理

應用SPSS 13.0軟件對數據進行統計分析，數據以中位數(四分位數間距)或表示，兩組間配對樣本采用Wilcoxon檢驗或t檢驗，兩組間獨立樣本采用Mann-Whitney檢驗，重復測量數據采用雙因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 miR-187*在癌組織和正常黏膜組織中的表達

miR-187*在40例患者癌組織中的表達量為0.165(0.106，0.428)，正常黏膜組織中的表達量為0.334(0.211，0.712)，差異有統計學意義(P=0.041，圖1)。

圖 1 miR-187＊在癌組織及正常黏膜的表達量Fig. 1 Expression of miR-187* in normal mucosa and cancer mucosa

2.2 miR-187*相對表達量與臨床病理的關系

miR-187*在黏液性腺癌中的表達量為0.110(0.070，0.390)，明顯低于非黏液癌［0.840(0.355，1.628)］，差異有統計學意義(P=0.001)；低齡患者(＜69歲)的表達量為1.270(0.435，1.955)，高齡患者(≥69歲)為0.390(0.150, 1.070)，差異有統計學意義(P=0.016)。miR-187*表達與分化程度、分期、浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移、性別無明顯關系，各指標組間差異無統計學意義(P＞0.05，表1)。

表 1 miR-187*的相對表達量與結直腸癌臨床病理特征的關系Tab. 1 The correlation of miR-187* expression in CRC with clinical significance

2.3 上調miR-187*表達量對結腸癌細胞凋亡的影響

轉染mimics進入HCT116細胞中，與對照組相比，實驗組miR-187*表達量上調(圖2)。實驗組早期凋亡率為(26.748±1.098)%，高于對照組［(23.010±1.279)%］，差異有統計學意義(P=0.024)；實驗組晚期凋亡率為(4.393±0.715)%，與對照組［(3.940±0.710)%］相比，差異無統計學意義(P＞0.05，圖3)。

圖2 轉染后miR-187＊表達量Fig.2 Expression of miR-187* in the transfected cells

圖3 miR-187*對HCT116細胞凋亡影響Fig.3 The effect of miR-187* on cell apoptosis of HCT116 cells

3 討 論

miRNA主要通過與靶標基因3’非翻譯區域(3’UTR)的完全或不完全配對，降解靶標基因mRNA或抑制其翻譯，miRNA還可以直接作用于mRNA加快脫腺苷化，導致mRNA降解加速，從而參與調控個體發育，細胞凋亡、增殖、分化、代謝和應激等生命活動［6］。近幾年研究表明，miRNA可能通過類似癌基因、抑癌基因或其他方式調控腫瘤的發生、發展和轉歸過程，表現出與癌基因或抑癌基因相似的生物學作用［7］；并且能與信號通路或原癌基因相互作用，對環境信號作出反應，從而對細胞增殖、凋亡、周期產生影響［8］。

miR-187*是miR-187家族的一員，位于18號染色體上［9］。Ho等［10］對45例毛細胞型星形細胞瘤標本研究發現，miR-187*在癌組織中的表達水平低于正常組織表達水平的2～2.5倍。Ma等［11］在研究結直腸癌表達譜時也發現，miR-187*在結直腸癌中低表達。Liu等［12］應用基因芯片技術對miRNAs在胃癌組織中篩查，并通過RT-PCR驗證發現miR-187*異常表達。隨后對miR-187*在10位健康人、10例胃癌患者、10例結直腸癌患者血清中表達水平進行檢測，發現其在胃癌患者血清中表達水平最高、結直腸癌次之、健康人最低，胃癌患者血清表達水平與健康人血清表達水平差異有統計學意義，提示miR-187*可能成為胃癌早期診斷的指標。

本實驗首先通過qRT-PCR方法檢測miR-187*在結直腸癌組織及正常黏膜組織中的表達，結果miR-187*在結直腸癌組織中低表達，與Ma等［11］的研究結果一致。

黏液癌是組織學分型中的一重要亞型。我國學者通過對2 079例結直腸癌患者的臨床資料及預后生存期進行回顧性研究，發現黏液癌患者預后差［13］。本實驗通過分析臨床病理資料發現，miR-187*的相對表達量在黏液癌中低表達更明顯，提示miR-187*對判斷結直腸癌的惡性程度及預后有一定意義。Bouassida等［14］研究發現，在結直腸癌年輕患者中組織學類型惡性度高、易侵犯血管發生轉移，但1年生存率無明顯變化。本研究結果發現，miR-187*的表達下調與組織學類型及發病年齡均相關。國內年齡＜39歲惡性腫瘤發病率處于較低水平，＞40歲快速升高，80歲達到高峰［2］。Chang等［15］通過對1988—2007年124 314例在中國臺灣癌癥登記的結直腸癌患者進行流行病學統計分析時發現，高年齡組的比例增加。本研究分析發現，miR-187*在高齡患者中的表達量較低，提示時序性的miR-187*表達下調，可能與隨年齡增長結直腸癌發病率逐步增高相關。

大量研究結果表明，miRNA參與調控細胞生物學行為。Tsang等［16］發現，由H19派生的miR-675在結直腸癌中高表達，可通過下調其靶基因RB促進腫瘤細胞增殖及細胞集落的形成，發揮癌基因的作用。miR-218在結直腸癌組織及細胞中低表達，通過下調BMI-1抑制結直腸癌細胞株HCT116及HT29的細胞增殖，延長細胞G2期，促進細胞凋亡［17］。miR-133b可通過MET信號轉導通路抑制SW620及HT29的增殖，促進凋亡發揮其抑癌作用［18］。本研究發現HCT116細胞中，實驗組miR-187*表達量高于對照組，提示上調miR-187*表達量可提高HCT116細胞早期凋亡率，發揮抑癌作用。

綜上所述，miR-187*可通過促進凋亡發揮抑癌作用，但具體信號通路有待進一步研究。miR-187*有望作為一個新的潛在生物學標志物用于判斷結直腸癌惡性程度及預后。

［1］ JEMAL A, BRAY F, CENTER M M, et al. Global cancer statistics［J］. CA Cancer J Clin, 2011, 61(2): 69-90.

［2］ 陳萬青, 張思維, 鄭榮壽, 等. 中國2009年惡性腫瘤發病和死亡分析［J］. 中國腫瘤, 2013, 22(1): 2-12.

［3］ 張升, 蔡國響, 蔡三軍. microRNA基因啟動子甲基化的檢測及其在結直腸癌臨床應用中的研究進展［J］. 中國癌癥雜志, 2012, 22(11): 869-872.

［4］ WEBER M, BAKER M B, PATEL R S, et al. MicroRNA Expression Profile in CAD Patients and the Impact of ACEI/ ARB［J］. Cardiol Res Pract, 2011, 2011: 532915.

［5］ PATUZZO C, PASQUALI A, TRABETTI E, et al. A preliminary microRNA analysis of non syndromic thoracic aortic aneurysms ［J］. Balkan J Med Genetics, 2012: 51-55.

［6］ WU L, FAN J, BELASCO J G. MicroRNAs direct rapid deadenylation of mRNA ［J］. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006, 103(11): 4034-4039.

［7］ BARTEL D P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function［J］. Cell, 2004, 116(2): 281-297.

［8］ LIU W, MAO S Y, ZHU W Y. Impact of tiny miRNAs on cancers［J］. World J Gastroenterol, 2007, 13(4): 497-502.

［9］ FERRACIN M, PEDRIALI M, VERONESE A, et al. MicroRNA profiling for the identification of cancers with unknown primary tissue-of- origin［J］. J Pathol, 2011, 225(1): 43-53.

［10］ HO C Y, BAR E, GIANNINI C, et al. MicroRNA profiling in pediatric pilocytic astrocytoma reveals biologically relevant targets, including PBX3, NFIB, and METAP2 ［J］. NeuroOncol, 2013, 15(1): 69-82.

［11］ MA Y, ZHANG P, WANG F, et al. miR-150 as a potential biomarker associated with prognosis and therapeutic outcome in colorectal cancer［J］. Gut, 2012, 61(10): 1447-1453.

［12］ LIU H, ZHU L, LIU B, et al. Genome-wide microRNA profiles identify miR-378 as a serum biomarker for early detection of gastric cancer［J］. Cancer Lett, 2012, 316(2): 196-203.

［13］ SONG W, WU S J, HE Y L, et al. Clinicopathologic features and survival of patients with colorectal mucinous, signetring cell or non-mucinous adenocarcinoma: experience at an institution in southern China［J］. Chin Med J (Engl), 2009, 122(13): 1486-1491.

［14］ BOUASSIDA M, FEIDI B, MROUA B, et al. Histopathologic characteristics and short-term outcomes of colorectal cancer in young Tunisian patients: one center's experience［J］. Pan Afr Med J, 2012, 12: 10.

［15］ CHANG H C, HORNG J T, LIN W C, et al. Evaluation of the appropriate age range of colorectal cancer screening based on the changing epidemiology in the past 20 years in Taiwan［J］. ISRN Gastroenterol, 2012; 2012: 960867［Epub 2012 Aug 30］.

［16］ TSANG W P, NG E K, NG S S, et al. Oncofetal H19-derived miR-675 regulates tumor suppressor RB in human colorectal cancer［J］. Carcinogenesis, 2010, 31(3): 350-358.

［17］ HE X, DONG Y, WU C W, et al. MicroRNA-218 inhibits cell cycle progression and promotes apoptosis in colon cancer by downregulating BMI1 Polycomb Ring Finger oncogene［J］. Mol Med, 2013, 18: 1491-1498.

［18］ HU G, CHEN D, LI X, et al. miR-133b regulates the MET proto-oncogene and inhibits the growth of colorectal cancer cells in vitro and in vivo［J］. Cancer Biol Ther, 2010, 10(2): 190-197.

《中國癌癥雜志》2013年征訂啟事

《中國癌癥雜志》是由國家教育部主管、復旦大學附屬腫瘤醫院主辦的全國性腫瘤學術期刊，讀者對象為從事腫瘤基礎、臨床防治研究的中高級工作者。主要報道內容：國內外研究前沿的快速報道、專家述評、腫瘤臨床研究、基礎研究、文獻綜述、學術討論、臨床病理討論、病例報道、講座和簡訊等?！吨袊┌Y雜志》已入選中文核心期刊、中國科技核心期刊及全國腫瘤類核心期刊，并為中國科技論文統計源期刊，先后被“中國期刊網”、“萬方數據——數字化期刊群”和“解放軍醫學圖書館數據庫（CMCC）”等收錄。

《中國癌癥雜志》為月刊，大16開，80頁銅版紙（隨文彩圖），每月30日出版，單價8元，全年96元。國際標準刊號1007-3639，國內統一標準刊號CN31-1727/R，郵發代號4-575。

讀者可在當地郵局訂閱，漏訂者可直接向本刊編輯部訂閱。

也歡迎廣大作者來稿。

主 編：沈鎮宙

主 任：秦 娟

聯系地址：上海市東安路270號復旦大學附屬腫瘤醫院內《中國癌癥雜志》編輯部

郵 編：200032

電 話：021-64188274；021-64175590×3574

網 址：www.china-oncology.com

電子郵件：zgaz@163.com

Down-regulation of microRNA-187* expression in colorectal cancer and its roles in promoting cell apoptosis

LIU Bo, TIAN Yan-feng, ZHAO Zeng-ren, FAN Zhi-bin, ZHANG Li-jing, HE Xin-qi, GAO Li-fei (Department of General Surgery, First Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang Hebei 050031, China)

ZHAO Zeng-ren E-mail: zzr-doctor@163.com

Background and purpose: MicroRNAs (miRNAs) play an important role in tumor biological behavior. miRNAs are down-regulated or up-regulated in various cancer types, triggering abnormal cell differentiation, proliferation and apoptosis. This study was designed to investigate the expression and clinical significance of miR-187* in colorectal cancer (CRC), and further to investigate its roles in promoting cell apoptosis. Methods: The expressions of miR-187* in 40 CRC cases were examined by real-time quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). The relationship between miR-187* expression and clinical features of CRC was analyzed. HCT116 cells were transfected with a miR-187* mimic and the apoptosis of the transfected cells were examined by flow cytometry (FCM). Results: The expression of miR-187* was down-regulated in CRC tissues 0.165 (0.106, 0.428) compared with those in normal tissues 0.334 (0.211, 0.712) (P＜0.05), especially in mucinous carcinoma and older age CRC (P＜0.05). Transfection of HCT116 cells with a miR-187* mimic up-regulated the expression of miR-187* and increased cell early apoptosis (P＜0.05). Conclusion: The expression level of miR-187* was lower in CRC. miR-187* expression correlates with histological type and age. Transfection of HCT116 cells with a miR-187* mimic accelerates apoptosis of tumor cells, suggesting that miR-187* is a potent tumor suppressor.

Colorectal cancer; microRNA; microRNA-187*; Apoptosis

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.09.002

R735.3

：A

：1007-3639(2013)09-0703-06

2013-05-20

2013-08-09）

國家自然科學基金資助項目(No: 81072034)；河北省自然科學基金資助項目(No: C2011206103)；河北省科技計劃項目(No: 12396105D)。

趙增仁 E-mail:zzr-doctor@163.com