PCR－焦磷酸測序檢測金黃色葡萄球菌研究

許龍巖 袁慕云 唐 勤 鄒志飛 相大鵬

(1.廣東出入境檢驗檢疫局 廣東廣州 510623;2.南方醫科大學)

1 前言

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是引起醫院感染和細菌性食物中毒的一種主要病原菌，該菌可分泌20多種毒性蛋白質［1，2］，日本的調查結果表明，平均32.5%的食品存在金黃色葡萄球菌的污染［3，4，］。隨著分子生物學的發展，已有用普通 PCR或熒光 PCR 檢測金黃色葡萄球菌的報道［5，6，7］，雖然這些方法可達到快速、高通量的目的，但卻無法獲得分子診斷的黃金標準－DNA堿基序列，因此有假陽性的可能。焦磷酸測序(pyrosequencing)技術是近年來發展的一項實時地進行短片段DNA測序技術，該技術在DNA序列分析時不需要電泳和熒光標記，直接測定測序引物后面的堿基序列，通過提供可靠的序列信息來確認PCR產物，同時由于主要分析PCR產物雙鏈中的一條鏈的序列，避免了由于DNA鏈的二級結構造成的人工假象，使測序結果更加準確［8］，目前應用于基因表達［9］、病毒檢測［10］、SNP 分析［11］、耐藥基因檢測［12］、真菌鑒定［13］、DNA甲基化分析［14］等多個領域。

本研究根據金黃色葡萄球菌凝固酶基因保守序列設計擴增引物和測序引物，建立了結合PCR－焦磷酸測序從DNA堿基序列水平上檢測金黃色葡萄球菌的方法，并評價了方法的特異性、與傳統檢測方法的符合性，以期實際應用于食品中金黃色葡萄球菌的檢測。

2 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 菌株來源

金黃色葡萄球菌共20株，其中標準菌株1株，不同食品中的分離株19株，菌株信息見表1。陰性對照菌株8株，分別為單增李斯特菌ATCC19115、阪崎腸桿菌 ATCC29544、藤黃微球菌CMCC28001、痢疾志賀氏菌NICPBP51252、小腸結腸炎耶爾森氏菌CMCC52221、肺炎克雷伯氏菌CMCC46102、糞鏈球菌ATCC2921、大腸桿菌ATCC25922。上述菌株來自中國普通微生物菌種保藏管理中心、中國藥品生物制品鑒定所和廣東出入境檢驗檢疫局技術中心，所有菌株均經VITEK 2和API試劑條進行了確證。

表1 金黃色葡萄球菌菌株信息

2.1.2 主要儀器和試劑

焦磷酸測序PyroMark lD系統：瑞典Biotage公司;7900PCR擴增儀：美國PE公司;全自動核酸純化系統12GC：日本 PSS公司;PCR用 Buffer、dNTP、瓊脂糖、PCR分子量標記(50－500bp)Taq酶，購自寶生物工程(大連)有限公司;鏈親和素標記磁珠：GE.Healthcare公司;焦磷酸測序用酶、dNTP、結合緩沖液、退火緩沖液、變性緩沖液、洗滌緩沖液等購自QIAGEN上海辦事處;7.5%氯化鈉肉湯：北京陸橋有限公司。

2.2 方法

2.2.1 引物設計

根據GenBank公布的金黃色葡萄球菌凝固酶基因序列中的保守區域，用PyroMark Assay Design軟件設計引物和測序引物，上游引物5'－AGCCATTAGTTAAAATTCCACAGG －3'，下游引物 5'－TTTAGATGAGCTACCTTCAAGACC －3'，測序引物5'－CTTTAAGCGATAATTATACT －3'，下游引物 5'端標記生物素，擴增片段大小為215bp，委托寶生物工程(大連)有限公司合成。

2.2.2 模板制備

所有菌株均用7.5%氯化鈉肉湯36℃培養18－24h，取1mL菌懸液移入離心管，12000 r/min離心5min去上清，用1mL去離子水漂浮沉淀，12000 r/min離心3min去上清，重復2次，最后加200μL去離子水在核酸提取儀上提取DNA，用于PCR擴增。

2.2.3 PCR擴增體系及電泳參數

擴增體系 50μL：PCR Mix Buffer25μL，Taq 酶5μL，MgCl21μL，10μmol/L 上、下游引物各 2μL，模板1μL，去離子水14μL。循環參數為預變性95℃5min;95℃15s，65℃ 30s，72℃ 30s，45 個循環;72℃12min，4℃保存。PCR產物一部分在2%瓊脂糖凝膠上電泳，另一部分用于焦磷酸測序。

2.2.4 單鏈模板制備及焦磷酸測序

將15μL PCR產物轉移至96孔PCR板中，加入2μL磁珠，20μL結合緩沖液和 43μL純水，常溫震蕩混20min;打開真空泵，將真空預裝工具 prep tool在高純水中清洗30 s，將prep tool移到96孔PCR板中，抓取其中的磁珠，待磁珠基本抓取完畢后將攜帶有磁珠的prep tool放入70%乙醇中5 s，再分別在變性緩沖液和洗滌緩沖液中各清洗20－30s，prep tool放在裝有退火預混液 PSQ 96板(預先加入43μL退火緩沖液和2μL測序引物)的上方，關掉真空泵，輕輕搖動釋放磁珠，將PSQ 96板在80℃放置5min，自然冷卻至室溫后進行焦磷酸測序反應。測序程序采用SQA模式，按ATCG的堿基排列順序，依次循環加入15次，根據軟件給出的劑量在試劑倉中加入底物混合物、酶混合物和4種脫氧核糖核苷酸，將PSQ96孔板和試劑倉放入PyroMark lD系統中進行焦磷酸測序。測序峰及相應的DNA堿基序列由儀器SQA軟件自動分析產生。

2.2.5 焦磷酸測序結果判斷

檢測的DNA堿基序列與測序引物后的DNA堿基序列比對判斷結果，即檢測的前29個DNA堿基序列為 CAACCGACGACACCGAACCCTATTTTAGA，則判斷為金黃色葡萄球菌。

2.2.6 模擬樣品檢測

用均質帶分別秤取25g豬肉、對蝦，每份樣品中加入225mL 7.5%氯化鈉肉湯緩沖蛋白胨水，分別加入1mL用已調好濃度的102cfu/mL金黃色葡萄球菌CMCC26003菌懸液，用拍擊式均質器拍打2 min，36℃ 培養18－20h，然后取一部分按上述步驟提取DNA進行焦磷酸檢測，另一部分按GB4789.10－2010《食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》繼續進行檢測。

3 結果與分析

3.1 PCR 擴增結果

凝固酶基因PCR擴增結果，20株金黃色葡萄球菌均擴增出215bp大小的DNA片段(圖1)，而單增李斯特氏菌、阪崎腸桿、藤黃微球菌、痢疾志賀氏菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌、肺炎克雷伯氏菌、糞鏈球菌、大腸桿菌等對照菌株未見擴增條帶(圖2)，表明設計的擴增引物具有較好的特異性，能特異性地擴增金黃色葡萄球菌。

圖1 金黃色葡萄球菌凝固酶基因PCR擴增電泳圖

圖2 金黃色葡萄球菌特異性試驗PCR擴增電泳圖

3.2 焦磷酸測序結果

20株金黃色葡萄球菌焦磷酸測序結果，根據模版濃度等條件的不同，測出38－44bp長短不等的DNA堿基序列(表2，圖3－圖4，其他測序結果圖略)，而單增李斯特菌等8株對照株未測出DNA堿基序列。測序所得20株金黃色葡萄球菌DNA堿基序列，分別與測序引物后的 DNA序列比對，發現100%匹配的DNA堿基數為29－44bp，所有有效測序結果均超過29個堿基(表2)，表明測序引物的特異性較好，并且可用CAACC GACGACACCG AACCCTATTT TAGA的DNA堿基序列特異性地檢測金黃色葡萄球菌。

表2 金黃色葡萄球菌焦磷酸測序檢測結果

(續表)

3.3 模擬樣品焦磷酸測序檢測結果

添加金黃色葡萄球菌CMCC26003菌懸液的豬肉、對蝦模擬樣品，分別檢測出與預期相符的DNA堿基序列，即CAACC GACGACACCG AACCCTATTT TAGA(圖略)。按照 GB4789.10－2010《食品微生物學檢驗金黃色葡萄球菌檢驗》檢測的模擬樣品，均分離鑒定出金黃色葡萄球菌，結果與本研究建立的焦磷酸測序方法一致。

圖3 BJ CMCC26003焦磷酸測序結果圖

圖4 JP1焦磷酸測序結果圖

4 討論

致病性較強的金黃色葡萄球菌可產生凝固酶，使血漿中纖維蛋白原轉變成纖維蛋白，附著于細菌表面成塊，凝塊包繞細菌使其免遭抗生素、抗體、吞噬等多種因素的作用。葡萄球菌有2種凝固酶，一種是分泌至菌體外的蛋白質稱為游離凝固酶，此酶與血漿中的凝固酶反應因子協同作用于纖維蛋白原，使血漿凝固，故可用試管法檢出;另一種結合于菌體表面并不釋放，稱為結合凝固酶或凝聚因子，它可直接作用于纖維蛋白原，可用玻片法檢出。凝固酶因子試驗和血漿凝固酶試驗是兩個不相關試驗，兩者不能相互替代，也不可相互印證。金黃色葡萄球菌既可產生凝固酶，亦可產生凝集因子，而血漿凝固酶試驗是鑒定金黃色葡萄球菌致病性的關鍵。我國國家標準GB4789.10－2010《食品微生物學檢驗金黃色葡萄球菌檢驗》，也將血漿凝固酶試驗作為鑒定金黃色葡萄球菌的指標［15，16，17］。

本研究根據血漿凝固酶基因DNA堿基序列中的保守區域，分別設計擴增引物和測序引物，建立了PCR－焦磷酸測序從DNA堿基序列水平上檢測金黃色葡萄球菌的方法，先對目標片段進行PCR擴增，保證擴增片段的特異性，再用擴增產物制備單鏈模板，在測序引物的引導下進行焦磷酸測序，檢測的DNA堿基序列與測序引物后的序列比對，前29個堿基序列100%匹配作為陽性結果，即序列為CAACC GACGACACCG AACCCTATTT TAGA，則判斷為金黃色葡萄球菌。PCR擴增試驗結果，擴增引物具有較好的特異性，20株金黃色葡萄球菌均擴增出215bp大小的DNA片段，而單增李斯特氏菌等其他對照菌株未擴增出DNA條帶。焦磷酸測序結果，20株金黃色葡萄球菌DNA堿基序列與測序引物后的堿基序列比對，100%匹配的堿基數分別為29－44bp，均超過需檢測的29個DNA堿基序列，而其他單增李斯特氏菌等對照菌株未測出DNA堿基序列。模擬樣品檢測結果，焦磷酸測序結果與傳統檢測方法一致，但在檢測周期上傳統方法需要培養、劃線分離、凝固酶試驗等，需要2－3d，而焦磷酸測序方法增菌18－24h、核酸提取、PCR擴增和焦磷酸測序3h，整個試驗21－27h完成，簡便快捷，而且可通DNA堿基序列的水平上檢測金黃色葡萄球菌，避免了單純PCR擴增檢測易污染造成的假陽性結果，準確性高，具有較好的應用前景。

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