超高效液相色譜－串聯質譜法測定豬肉和豬尿中的苯乙醇胺A

盧艷芬

(長沙市畜禽水產品質量檢測中心 湖南長沙 410013)

1 前言

苯乙醇胺A又稱為克侖巴胺，化學名稱為2－4－(4－硝基苯基)丁基－2－基氨基－1－甲氧基苯乙醇，是一種人工合成的化學物質。苯乙醇胺A是福莫特羅的同分異構體，是美國禮來公司合成萊克多巴胺時產生的副產物，具有同克侖特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇等藥物相同的作用和效果，屬于β－受體激動劑。苯乙醇胺A同樣具有營養再分配作用［1］，可以用于刺激動物生長，加強蛋白質在動物體內沉積，提高基礎代謝水平，使體脂趨于分解，促進生豬長速加快，提高瘦肉率［2］。而人吃了含這種藥物的豬肉后，可出現惡心、頭暈、四肢無力、手顫等中毒癥狀，特別是對心臟病、高血壓患者危害更大［3］。2010年12月農業部公告禁止在飼料和動物飲用水中添加該物質［4］。

目前，關于動物源性食品中β2－受體激動劑類藥物殘留檢測的報道較多［5－8］，但關于苯乙醇胺A在動物源性食品及動物尿液中檢測方法的研究非常少［9，10］。孫志文等利用酶解16h后反萃再過SPE小柱的處理方法，經液相色譜－串聯質譜儀檢測豬肌肉中的苯乙醇胺A［11］。本文對豬尿和豬肉中苯乙醇胺A的酶解、固相萃取等提取方法和色譜質譜測定進行了系列研究，設計出了快速、準確、靈敏度高的苯乙醇胺A超高效液相色譜串聯質譜測定法。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 儀器

UPLC－MS/MS：waters公司TQD系列;離心機：湘儀H－1650型;固相萃取裝置：Alltech;pH計：雷磁PHSJ－4A型;渦旋混勻器：德國IKA，MS3型;振蕩器：蘇州威爾 SHA－C型;超聲儀：昆山 KQ－500DE型;氮氣吹干儀：美國N－EVAPTM112型;固相萃取柱：waters公司MCX，60mg/3mL。

2.1.2 試劑

苯乙醇胺A標準品 (多倫多化學研究公司);甲醇(色譜純，Merck);高氯酸(分析純);β－鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶(Merck);乙酸銨(色譜純，TEDIA);甲酸(色譜純);氨水(分析純);乙酸(分析純);鹽酸(分析純)。

2.2 方法

2.2.1 液相色譜參考條件

色譜柱：BEH C18(50*2.1mm，1.7μm);流動相：A相為0.1%甲酸水溶液，B相為甲醇溶液;梯度洗脫：0 －3.4min 維持 95.0%A，3.4 －3.6min 為95%A 變化至72%A，3.6 －5.5min 維持72%A，5.5－5.7min為72%A 變化至 30%A，5.7 －6.7min維持30%A，6.7－8min為30%A變化至95%A。流速：0.3mL/min;柱溫：35℃;進樣量：4μL。

2.2.2 質譜參考條件

電噴霧離子源;正離子掃描;多反應檢測;電離電壓：3.0kV;源溫：120℃;霧化溫度：350℃;錐孔氣流速：50L/h;霧化氣流速：580L/h。苯乙醇胺A的檢測條件如表1。

表1 苯乙醇胺A最優化的質譜參數

2.2.3 樣品前處理

2.2.3.1 豬肉樣品

酶解：準確稱取2g樣品于50mL離心管里，加入0.2mol/L 乙酸銨緩沖溶液(pH=5.2)8.0mL，加入β－鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶40μL，渦旋混勻，于52℃下避光水浴震蕩反應2 h。提?。好附夂蠓胖弥潦覝?，用高氯酸調pH至1，渦旋混勻，于80℃水浴中超聲30min，11000r/min高速離心10min，傾出上清液于另一50mL離心管里，加入0.1mol/L高氯酸溶液4mL于殘渣中，渦旋并超聲10min后11000r/min高速離心10min。合并上清液，用10mol/L氫氧化鈉溶液調節pH至4，待用。

凈化：MCX小柱依次用3mL甲醇，3mL水活化，取備用液的1/2過柱，再依次用3mL 0.1mol/L高氯酸溶液，3mL甲醇淋洗，抽干，用3mL 5%氨化甲醇洗脫。洗脫液在40℃下用氮氣吹干，用甲醇+0.1%甲酸溶液(5+95)1mL溶解，渦旋混勻，過0.22μm有機濾膜，供液質聯用儀用。

2.2.3.2 豬尿樣品

準確移取2mL尿樣于50mL離心管中，加入2mol/L 乙酸銨溶液(pH=5.2)200μL，用乙酸調pH至5.2，加入40μLβ － 鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，渦旋混勻，52℃下水浴振蕩器中反應2h。反應完成后11000r/min離心10min，取上清液全部過MCX固相萃取小柱。MCX柱依次用3mL甲醇、3 mL水對柱子進行活化，依次用3mL 2%甲酸溶液、3mL甲醇淋洗，用3mL 5%氨化甲醇溶液進行洗脫，收集洗脫液，在45℃下氮氣吹干，加入甲醇+0.1%的甲酸溶液 (5+95)2mL溶解殘渣，過0.22μm濾膜后待測。

3 結果與討論

3.1 前處理條件的優化

β－興奮劑依據其結構可分為苯胺型(典型化合物如克倫特羅)和苯酚型(典型化合物如萊克多巴胺)兩大類。苯乙醇胺A屬于苯酚型結構，為中等極性的疏水性化合物，易溶于酸性溶液、堿性溶液、甲醇、乙酸乙酯等極性溶劑。因此，設計殘留分析時，多以酸性混合有機溶劑為提取液進行提取。

苯酚型激動劑在動物機體的代謝以軛合態存在，故其殘留檢測必須要經過水解過程。通常的水解方法有酸解［12，13］、堿解［14］和酶解［15，16］等，而對于豬肉和豬尿，通常采用酸解和酶解兩種方法?？紤]到酸解成本低，反應后的雜質少等特點，我們在設計提取方案時，首先考慮的是酸解提取?？疾炝瞬煌乃峤鉂舛?0.2、0.5、1、2mol/L 等 )和不同酸解溫度(60、80℃)下的提取條件。結果發現：對于苯酚型的受體激動劑如沙丁胺醇、萊克多巴胺等，由于其高軛合率，酸解不能將其全部游離出來，致使目標化合物回收率低，無法滿足檢測要求。因此，改用酶解方法進行提取。在現有的文獻資料中，β－興奮劑的酶解一般都需要反應12－16h［17］。這樣長時間的酶解不適用于實際工作中的快速監測。為此，本文對β－興奮劑類化合物的酶解條件進行了研究，以期找到合適的酶解條件。苯乙醇胺A與沙丁胺醇和萊克多巴胺都屬于苯酚型。由于實際工作中沒有苯乙醇胺A的陽性樣品，故以沙丁胺醇陽性豬尿為考察對象，研究了52℃下豬尿中沙丁胺醇的酶解時間(1－16h)與酶解效率的關系，以及與傳統37℃16h酶解方法的比較。結果見表2。從表2中可以看出，在52℃下 ，酶解2h時，豬尿中沙丁胺醇的酶解濃度已經達到了峰值，且與37℃16h酶解條件下的峰面積值相當。在改變酶解溫度的同時，還增加了高氯酸沉降蛋白、80℃高溫滅活及超聲提取等步驟，以進一步提高回收率。

表2 不同酶解條件下豬尿中的沙丁胺醇峰面積

3.2 色譜質譜條件的優化

根據苯乙醇胺A的化學結構及性質，選取BEH C18(50*2.1mm，1.7μm)色譜柱進行分析。此外，在流動相中加入適量的甲酸以增加其檢測的靈敏度，在合適的條件下，苯乙醇胺A在6.12 min左右出峰，總運行時間為8min，保證了在樣品中雜質組分與目標化合物的有效分離，從而減少了基質的干擾和抑制作用。此外，為增加測試的準確度，本實驗采用空白基質加標準品的方法來做標準工作曲線。

為獲得較高靈敏度的檢測結果和消除基質對目標物質的抑制作用，在本實驗中采用空白基質加苯乙醇胺A標準溶液進行調諧，選取最優的毛細管電壓、碰撞能等參數，其結果見表1。苯乙醇胺A的二級質譜圖和提取離子多反應監測圖見圖1和圖2。

圖1 苯乙醇胺A的二級質譜圖

圖2 苯乙醇胺A的多反應監測色譜圖

3.3 方法的線性關系和測定限

3.3.1 方法的線性關系

用甲醇+0.1%甲酸水(5+95)配制系列濃度標準工作溶液：0.2、1、2、5、10、20、50μg/L。在確定的實驗條件下進樣分析，制作標準工作曲線，其結果見圖3。從圖中可以看出在0.2μg/L －50μg/L的濃度范圍內，苯乙醇胺A相關系數大于0.9999，線性范圍寬，線性相關性好。

圖3 苯乙醇胺A的標準工作曲線

3.3.2 方法的靈敏度

本方法條件下，測得苯乙醇胺 A的檢測限(LOD，S/N=3)和定量限 (LOQ，S/N=10)分別為0.2μg/kg、0.5μg/kg(豬肉)和 0.2μg/L、5μg/L(豬尿)。多反應監測圖見圖4和圖5。

圖4 空白豬肉樣品添加苯乙醇胺A的多反應監測色譜圖(0.2μg/kg、0.5μg/kg)

圖5 空白豬尿樣品添加苯乙醇胺A的多反應監測色譜圖(0.2μg/L、0.5μg/L)

3.4 方法的回收率和精密度

對空白豬肉和豬尿樣品進行了3個濃度的添加回收實驗：0.5、1、2μg/kg 和 0.5、1、2μg/L。每個濃度做6次平行測定，苯乙醇胺A測定的回收率和精密度結果見表3。

表3 回收率與精密度實驗結果(n=6)

豬肉樣品的回收率為79.0% －103%，相對標準偏差為4.1% －12.5%;豬尿樣品的回收率為80.3% －102%，相對標準偏差為：5.9% －13.7%。

4 方法的協同實驗

本方法在我中心實驗室制定完成后，與湖南省出入境檢驗局檢驗檢疫技術中心、長沙市食品質量安全監督檢測中心對其進行了協同驗證實驗。豬尿和豬肉各3個添加濃度、每個濃度進行6次平行測定。協同實驗結果：豬肉中0.5、1、2μg/kg 添加回收率在71.0% －107%之間，變異系數在2.1% －15.1%之間;豬尿中 0.5、1、2μg/L 添加回收率在76% －105%之間，變異系數在2.46% －11.93%之間。

5 結論

本研究建立了豬肉和豬尿中苯乙醇胺A殘留的UPLC－MS/MS快速定性和定量方法，將酶解時間從現有各標準中的12－16h縮短到2h，大大節約了分析時間;樣品處理方法簡單，有機溶劑消耗少，節約了分析成本。方法精密度和準確度高，實用性強，適用于生豬屠宰前后豬尿和豬肉中苯乙醇胺A殘留監控。

［1］丁煥中，陳杖榴，楊志凌.營養重分配劑萊克多巴胺的藥理作用和應用［J］.獸藥與飼料添加劑，2002，1(7)：18 －20.

［2］Pan S J，Hancock J，Ding Z P，et al.Effects of clenbuterol on insulin resistance in conscious obese Zucker rats［J］.Am J Physiol Endocrinol Metab，2001，280：E554-E561.

［3］Alida A M，Stolker，Paulus W，et al.The use of supercritical fluid extraction for the determination of steroids in animal tissues［J］.Analyst，1998，123(12)：2671 －2676.

［4］中華人民共和國農業部公告第1519號［Z］.

［5］牛晉陽，龐宇.姚欣樂.液質法測定豬肉中十種β－興奮劑殘留［J］.食品科學，2010，31(8)：241－244.

［6］趙善貞，陳舜勝，鄧曉軍，等.高效液相色譜－串聯質譜法測定動物源性食品的4種β－興奮劑殘留量［J］.理化檢驗－化學分冊，2009，45(8)：968 －971.

［7］安洪澤，張素霞，沈建忠，等.高效液相色譜一紫外串聯熒光檢測法測定豬飼料中五種β－興奮劑［J］.飼料工業，2008，29(6)：54 －56.

［8］M W F Nielen，J J P Lasaroms，M L Essers，et al.Multiresidue analysis of beta－ agonists in bovine and porcine urine，feed and hair using liquid chromatography electrospray ionisation tandem mass spectrometry［J］.Analytical and Bioanalytical Chemistry，2008，391(1)：199 －210.

［9］農業部1486號公告－1－2010飼料中苯乙醇胺A的測定高效液相色譜－串聯質譜法［S］.

［10］曲斌，鄭勝蘭，陸桂萍，等.固相萃?。璘PLC－MS/MS快速測定豬尿中的苯乙醇胺 A［J］.中國獸藥雜志，2012，46(1)：25－27.

［11］孫志文，閆小峰.豬肌肉組織中苯乙醇胺A殘留液相色譜－串聯質譜檢測方法［J］.中國獸醫雜志，2011，47(4)：72 －74.

［12］Katia D W，Hubert D B，Dirk C.LC －MS－MS to detect and identify four beta－agonists and quantify clenbuterol in liver［J］.Analyst，1998，123(12)：2701 －2705.

［13］Philippe A G，Marie－ Ckaude S，Richard H.Quantitative analysis of clenbuterol in meat products using liquid chromatographyelectrospray ionizations tandem mass spectrometry［J］.Journal of Chromatography B：Biomedical Sciences and Applications，1999，736(1 －2)：209 －219.

［14］Fente C A，Vazquez B I，Franco C，et al.Determination of clenbuterol residues in bovine hair by using diphasic dialysis and gas chromatography－mass spectrometry［J］.Journal of Chromatography B：Biomedical Sciences and Applications，1999，726(1 －2)：133－139.

［15］Lucia D，Rosa V，Jordi O，et al.Derivatization procedures for the detection of β2－agonist by gas chromatographic mass spectrometric analysis［J］.Journal of Mass Spectrometry，2000，35(11)：1285 －1294.

［16］O’Keeffe M J，O’Keeffe M，Glennon J D.Supercritical fluid extraction(SFE)as a multi－ residue extraction procedure for β－ agonists in bovine liver tissue［J］.Analyst，1999，124(9)：1355－1360.

［17］Hogendoorn E A，van Zoonen P，Polettini A ，et al.Hyphenation of Coupled－column Liquid Chromatography and Thermospray Tandem Mass Spectrometry for the Rapid Determination of β－Agonist Residues in Bovine Urine Using Direct Large－volume Sample Injection［J］.J Mass Spectrom，1996，31(4)：418－426.