能力驗證樣品中沙門氏菌的分離與鑒定

游勇來 趙瓊 陳志耿

(從化出入境檢驗檢疫局 廣東從化 510900)

1 前言

沙門氏菌(Salmonella sp.)是一群形態、培養、生化反應和抗原構造類似的革蘭氏陰性桿菌，屬于需氧或兼性厭氧菌，種類繁多，廣泛分布于自然界，很容易在動物與動物、動物與人、人與人之間通過直接或間接的途徑傳播，沒有中間宿主，能引起人和動物傷寒、副傷寒和食物中毒，臨床表現為急性腸胃炎癥，有突發性劇烈頭痛、腹瀉、嘔吐、感覺不適和體溫升高等［1］。世界上，每年由沙門氏菌引起的食物中毒病例多達幾千萬;在我國，由沙門氏菌引起的食物中毒占首位，而且由其引起的動物感染也十分嚴重，已引起各界學者的廣泛重視［2］。

為了加強實驗室的能力建設，提高對致病菌的檢測水平，確保檢驗結果的準確性，2012年我局綜合實驗室參加了由CNAS組織的牛肉中沙門氏菌的能力驗證測試，現將參加本次能力驗證測試中沙門氏菌的分離與鑒定過程及結果進行總結報告如下。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 樣品

能力驗證樣品：編號分別為 093、139、195，由CNAS組織方提供。樣品為混合菌凍干粉末，采用西林瓶真空密閉包裝。

2.1.2 培養基和試劑

緩沖蛋白胨水(BPW)、四硫磺酸鈉煌綠增菌液(TTB)、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(SC)、HE瓊脂、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂(XLD)、平板計數瓊脂(PCA)、氧化酶試紙等：購自北京路橋技術有限公司，均在有效期內;API 20E試劑條：批號1001118400，用編號為CMCC50115的沙門氏菌標準株驗證結果相符，法國生物梅里埃生產;沙門氏菌屬多價診斷血清(A－F群)：批號20111020，無污染，用沙門氏菌標準株驗證結果相符，寧波天潤生產;沙門氏菌診斷血清：共59種，批號20111124，無污染，用沙門氏菌標準株驗證結果相符，蘭州生物制品研究所生產。

2.1.3 主要儀器設備

生物梅里埃微生物分析系統，二級生物安全柜，恒溫培養箱，生物顯微鏡，恒溫水浴鍋，渦旋振蕩器。

2.2 方法［3］［4］

2.2.1 樣品處理

按照組織方提供的《參試指導書》，以無菌操作將樣品用滅菌的生理鹽水進行再水化(即溶解)定容至25mL，此液體即為測試樣品(原液)，測試前充分混勻樣品。

2.2.2 增菌

2.2.2.1 前增菌

將原液加入盛有225mL帶玻璃珠(直徑3－4mm，約50粒)的無菌BPW的三角瓶中，充分振蕩混勻，放入36±1℃培養箱中進行培養18h，前增菌培養情況見表1。

表1 前增菌培養情況

2.2.2.2 選擇性增菌

輕輕搖動培養過的前增菌液，分別無菌移取1mL，轉種于10mL TTB增菌液和10mL SC增菌液進行培養，選擇性增菌培養情況見表2。

表2 選擇性增菌培養情況

2.2.3 分離培養

將2.2.2.2培養結束的增菌液分別搖勻，以無菌操作，用直徑3mm的接種環挑取增菌液各一環，分別劃線接種于一個HE瓊脂平板和一個XLD瓊脂平板進行培養，培養結束后觀察各個平板上有無生長典型或可疑沙門氏菌屬的菌落。

2.2.4 生化試驗

將2.2.3得到的可疑沙門氏菌屬分別純化至平板計數瓊脂(PCA)上，然后進行氧化酶試驗和API 20E生化試驗。

2.2.5 血清學凝集試驗

將生化試驗結果符合沙門氏菌屬特性的菌株做血清學凝集試驗。采用玻片凝集法，在潔凈玻片上滴加一滴A－F群多價O血清，用接種針挑取對應三糖鐵瓊脂斜面上的可疑沙門氏菌屬菌落，與多價血清混合均勻，30s內觀察凝集反應，同時用生理鹽水做對照;接著用各群O抗原因子血清即O4、O3、O10、O7、O8、O9、O2和 O11對被檢菌逐一進行凝集試驗檢查，再用陽性反應群所包含的各個O因子血清確定其O抗原組成，然后再用該菌所屬群的H因子血清檢查第1相和第2相的H抗原。

3 結果

3.1 分離培養

093號樣品的TTB和SC增菌液在HE瓊脂平板上分離出無色半透明中間有黑心的單菌落，取其中兩株典型菌落分別標注為S1、S2，在XLD上分離出黑色的單菌落，取其中兩株典型菌落分別標注為S3、S4;139號樣品的TTB和SC增菌液在HE瓊脂平板上分離出無色半透明中間有黑心的單菌落，取其中兩株典型菌落分別標注為S5、S6，在XLD上分離出黑色和黃色的單菌落，取其中兩株典型菌落分別標注為S7、S8;195號樣品的TTB和SC增菌液在HE瓊脂平板和XLD上均沒有分離到典型或可疑沙門菌落。

3.2 生化試驗

將分離到得可疑沙門氏菌 S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8分別接種至平板計數瓊脂(PCA)進行純培養，做API 20E生化試驗，結果見表3。

表3 API 20E生化試驗結果

根據上述API 20E生化試驗結果可以看出，S1、S2、S3、S4 為同一株菌，生化譜均為0736000，S5、S6、S7、S8為另一株菌，生化譜均為4504552。上述2株菌分別利用API 20E V4.1軟件查詢鑒定結果，結果分別見圖1和圖2。S1、S2、S3、S4為奇異變形桿菌，%id=99.9%，T=1.0(圖1);S5、S6、S7、S8 為沙門氏菌屬，%id=96.6%，T=0.94(圖 2)。

圖1 菌株S1、S2、S3、S4鑒定結果

圖2 菌株S5、S6、S7、S8鑒定結果

3.3 氧化酶試驗

挑取平板計數瓊脂平板上純化后的菌落進行氧化酶試驗，菌株 S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7 和 S8 的結果均為陰性。

3.4 血清學試驗

為了確定分離到的沙門氏菌屬的菌型，取其中一株S5做了血清學試驗。利用玻片凝集法，菌株S5與A－F多價O血清發生凝集反應，而生理鹽水對照不發生凝集。通過O抗原因子血清即O4、O3、O10、O7、O8、O9、O2和 O11逐一對菌株 S5 做凝集試驗，結果發現菌株S5與O9單因子血清發生凝集。參考GB 4789.4－2010常見沙門氏菌抗原表，估計該菌株可能屬于沙門氏菌D群。再用D群的H因子血清結合8種多價H血清檢查第1相和第2相的H抗原，結果篩查出菌株S5的抗原模式為1，9，12：g，m：［1，7］，確定菌株 S5 為腸炎沙門氏菌(S.enteritidis)。

3.5 判定

綜合上述鑒定結果，判定樣品093、195沙門氏菌未檢出;樣品139沙門氏菌檢出，菌型為腸炎沙門氏菌(S.enteritidis)，與收到CNAS的報告結果相符，結果為滿意。

4 討論

(1)由于參試樣品為凍干粉，所以收到樣品后應放置冰箱4℃中保存并盡快進行檢測。

(2)由于組織方在樣品發送前摻雜了多種干擾菌，為了不使目標菌漏檢，檢測過程盡量在無菌環境中無菌操作，防止污染菌進入樣品。同時還要防止操作人員被感染，試驗過程要注意生物安全。

(3)先用緩沖蛋白胨水(BPW)對樣品進行前增菌十分必要，若直接進行選擇性增菌，很可能使受損待測菌株的生物學特性不能得到完全恢復，容易造成假陰性結果。盡量采用多種選擇性平板和同時使用各種選擇性增菌液，同一種選擇性平板劃線分離時盡量多劃，避免某些平板劃線分離效果不好影響單菌落的分離，培養結束后要仔細觀察可疑菌落的特征。

(4)在選擇性平板培養基上，有很多菌落與沙門氏菌相似，特別是奇異變形桿菌、弗氏檸檬酸桿菌等由于產硫化氫，可在HE瓊脂上形成中心黑色、邊緣光滑整齊的菌落，與沙門氏菌極為相似［5］。

(5)生化鑒定時盡量選擇品質好的試劑，對生物學特性較為穩定的腸桿菌科屬菌株進行鑒定時，不僅操作簡便，而且結果準確性也比較高。

(6)關鍵的診斷試劑，如血清、生化鑒定試劑應先做質控，即用標準菌株做證實試驗，確定無質量問題后再使用。

［1］盤寶進，黃利平.熟制加工食品－鵝肝中沙門氏菌分離與鑒定［J］.現代食品科技，2006，22(2)：223 －224.

［2］王章云.腸炎沙門氏菌引起的食物中毒細菌學調查［J］.中國人獸共患病雜志，1999，15(3)：115.

［3］GB 4789.4－2010食品衛生微生物學檢驗：沙門氏菌檢驗［S］.

［4］SN0172－92出口食品中金黃色葡萄球菌檢驗方法［S］.

［5］趙貴明.食品微生物實驗室工作指南［M］.北京：中國標準出版社，2005：141 －142.