亞臨界水-固相萃取有機磷殘留前處理技術

王嘯，林翠萍，張燕

（天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津市食品營養與安全重點實驗室，天津 300457）

亞臨界水萃?。⊿ubcritical water extraction，SCWE）是近些年來新興的一種樣品前處理技術，主要是利用亞臨界水作為萃取溶劑將分析物從固體介質中萃取出來。亞臨界水是指在一定壓力條件下，將水加熱到高溫狀態，水相仍然保持在液態[1]。因為隨著溫度的升高，亞臨界水的介電常數會顯著降低，從室溫時的80降到250 ℃時的26.8，甚至其密度和介電常數在300 ℃時接近丙酮，因此能溶解多數環境和生物樣品中的不溶或者難溶的有機污染物[2]。

亞臨界水萃取技術在食品[3-4]、環境[5-8]等分析中已有較多應用研究。蘇明偉等[9]采用亞臨界水萃取-酶抑制法快速檢測果蔬中的甲胺磷、敵百蟲、敵敵畏等有機磷類農藥殘留，結果表明，萃取效率大于振蕩萃取及超聲波輔助萃取法。本文采用亞臨界水萃取技術對蔬菜中氨基甲酸酯類和有機磷進行樣品前處理，對萃取時間、萃取溫度、pH 等影響因素進行了優化研究，并且與傳統萃取方法進行了比較，結果表明亞臨界水萃取的萃取回收率高于液液萃取和超聲波輔助萃取。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

TTC-24 型亞臨界水萃取儀購于湖北眾康生物科技有限公司，配15 mL 亞臨界水萃取管（美國，HACH 公司）。

有機磷農藥采用安捷倫6820 氣相色譜儀進行檢測（美國，Agilent 公司），配氮磷檢測器（NPD），DB-5毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為N2（99.999 9%），流速：1 mL/min，氫氣流速：3 mL/min，空氣流速：60 mL/min，進樣口溫度為250 ℃；升溫程序：60 ℃保持1 min，15 ℃/min 升至200 ℃，保持2 min，5 ℃/min 升溫至250 ℃，保持5 min。檢測器溫度為325 ℃。進樣量：1 μL，采用不分流進樣。相對保留時間定性，外標法定量。

1.1.2 試劑

有機磷類農藥包括甲基對硫磷、殺螟松、毒死蜱、甲基溴硫磷、稻豐散，都是購于Sigma 公司。配制成100 mg/L 的標準儲備溶液，使用時將標準儲備溶液稀釋至40 mg/L 工作溶液。

乙腈（色譜純）、正己烷（色譜純）、丙酮（色譜純）、磷酸二氫鈉（分析純）。實驗用水均為天津科技大學食品工程與生物技術學院食品營養與安全重點實驗室自制去離子水。

實驗中蔬菜樣品購于天津科技大學附近集貿市場。

1.2 樣品制備

將新鮮的白菜清洗干凈、晾干后，剪碎成約1 cm×1 cm 碎片，準確稱取1.0 g 放入亞臨界水萃取管中，向管中加入100 μL 40 mg/L 的工作溶液，旋緊管塞，放置過夜，讓菜葉充分吸收農藥，待測。

1.3 亞臨界水萃取條件優化

向放置有白菜樣品的亞臨界水萃取管中加入10 mL一定pH 的磷酸鹽緩沖溶液，旋緊管塞，然后放入亞臨界水萃取儀中在一定溫度下加熱萃取一段時間，快速取出并水浴冷卻至室溫。分別研究不同萃取溫度、萃取時間和pH 對添加農藥回收率的影響，優化亞臨界水萃取條件。

1.4 固相萃取條件優化

將商用C18 固相萃取小柱依次使用10 mL 甲醇、5 mL 蒸餾水進行活化，并且在蒸餾水未干之前將萃取溶液過C18 固相萃取小柱進行吸附，之后用丙酮-正己烷（體積比50/50）10 mL 以0.5 mL/min 速度洗脫，收集洗脫液，減壓旋蒸濃縮，用正己烷定容，利用GC 進行分析。

2 結果與討論

2.1 標準曲線的制備

將5 種農藥標準品配置成不同濃度的混合標準溶液，以濃度為橫坐標，峰高為縱坐標建立工作曲線，結果表明，被測組分樣品濃度在0.01 mg/L～1 mg/L 范圍內與其色譜峰面積成線性關系，線性相關系數0.991 3～0.998 2 之間，被測組分的線性回歸方程和相關系數見表1。

表1 有機磷的標準曲線、線性相關系數、檢出限Table 1 The standard curve，linearity and detection limits of organophosphorous

2.2 亞臨界水萃取條件優化

2.2.1 萃取溫度對萃取效率的影響

在亞臨界水萃取中，萃取溫度對萃取效率影響最大。隨著溫度的升高，水的極性、表面張力和黏度都急劇下降，使得亞臨界水的萃取效率增加。以10 mL pH=8 的磷酸鹽緩沖溶液作為萃取溶劑，在50～120 ℃之間萃取5 min，以確定萃取溫度對萃取效率的影響。結果如圖1 所示。

圖1 溫度對回收率的影響Fig.1 Influence of temperature on the recoveries

由圖1 可知，在研究的溫度范圍內，隨著溫度的升高，各種農藥的回收率也隨之增大，其中殺螟松在70 ℃時，回收率達到最大，并且在70 ℃～90 ℃基本保持恒定，甲基溴硫磷在80 ℃～90 ℃，回收率達到最大，其他的農藥在90 ℃達到最大回收率，之后隨之溫度的升高，回收率又開始下降，這主要是由于高溫下，亞臨界水的極性降低，對極性物質的溶解度也會隨之降低，并且農藥在較高溫度的不穩定性也會使回收率降低。因此，實驗中亞臨界水萃取的溫度確定為90 ℃。

2.2.2 萃取時間對萃取效率的影響

以10 mL pH=8 的磷酸鹽緩沖溶液為萃取溶劑，在萃取溫度為90 ℃的條件下，萃取不同的時間，確定萃取時間對萃取效率的影響（見圖2）。

圖2 萃取時間對回收率的影響Fig.2 Influence of time on the recoveries

萃取時間延長有利于達到萃取平衡，提高萃取效率，但是過長的萃取時間，可能使其發生降解，影響萃取效率。研究發現，甲基溴硫磷和稻豐散在4 min～5 min 時達到最大回收率，而其它農藥在5 min 時達到最大回收率，之后隨著溫度的升高回收率開始下降，因此，實驗中亞臨界水萃取的時間確定為5 min。

2.2.3 pH 對萃取效率的影響

常溫下，有機磷類農藥在酸性條件下較穩定，而在堿性條件下，會發生降解。實驗中使用磷酸鹽配制成不同pH 的緩沖溶液，取10 mL 作為萃取液，在萃取溫度為90 ℃，萃取時間為5 min 的條件下，研究了不同pH 對萃取效果的影響。結果如圖3 所示。

圖3 pH 對萃取回收率的影響Fig.3 Influence of pH on the recoveries

在pH 5～9 的范圍內，萃取回收率上升，在pH=8時，達到最大值，然后隨著pH 的升高回收率反而下降，因此，實驗選擇萃取液的最佳pH=8。

2.3 亞臨界水萃取與其它前處理方法的對比

利用亞臨界水萃取-固相萃取和其它前處理技術對添加了同一濃度的樣品進行了分析，回收率結果見表2。

表2 不同前處理方法的回收率對比Table 2 The comparison of recoveries by different methods

從表2 中可以看出，在亞臨界水萃取條件下，殺螟松和甲基溴硫磷的回收率低于其它兩種前處理技術，這可能是由于殺螟松和甲基溴硫磷本身在水中溶解度過低，萃取過程中能夠有效萃取的量太少，而在亞臨界水萃取過程中，其它幾種農藥的回收率在90%～100%之間，高于其它兩種前處理技術。因此，使用亞臨界水萃取比其他兩種前處理技術的效果更好。圖4是5 種有機磷農藥的氣相色譜圖。

根據保留時間：甲基對硫磷是18.242 min，殺螟松是20.259 min，毒死蜱是20.907 min，甲基溴硫磷是21.167 min，稻豐散是21.931 min。

圖4 有機磷農藥的氣相色譜圖Fig.4 Gas chromatography of orgnaophosphorus pesticides

3 結論

研究了亞臨界水萃取對蔬菜中有機磷農藥殘留的萃取效果，對亞臨界水萃取的影響條件進行了優化研究。研究結果表明，采用10 mL pH=8.0 的磷酸鹽緩沖溶液作為萃取液，在萃取溫度90 ℃，萃取時間5 min的萃取條件下，有機磷類農藥具有較高的萃取效率。同時，與液-液萃取法和超聲輔助萃取法相比，亞臨界水-固相萃取方法具有萃取時間短、萃取效率高、不使用有機試劑、對環境造成污染少以及成本低等優點。

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