37種脂肪酸甲酯的色譜分離及QSRR研究

李 煥，李美萍，張生萬

(山西大學生命科學學院，山西太原030006)

脂肪酸作為人體的必需營養素之一，在整個生命過程中起著至關重要的作用。隨著生活水平的提高，人們對健康越來越重視，因此，業內專家和科研人員對膳食脂肪酸的研究也越來越多。目前，脂肪酸的檢測方法最常用的是氣相色譜［1－3］和氣相色譜－質譜聯用［4－5］。采用氣相色譜檢測，需要標準品對樣品進行定性;采用氣質聯用分析時，需要人工檢索解析，操作麻煩耗時，且費用較高。而定量結構－色譜保留相關 (QuantitativeStructure－Retention Relationships，QSRR)的研究主要是建立化合物分子結構參數和色譜保留值之間的定量關系，對選擇分離條件、預測保留時間和探索色譜保留機理有著重要的意義。建立有效的脂肪酸甲酯化合物QSRR模型可以節省大量的人力財力，同時對脂肪酸的分析工作具有一定的指導意義。由于油脂中脂肪酸組成復雜，且結構相似，對分離柱的要求就相對較高。目前，應用較為廣泛的是涂漬極性固定相的色譜柱，如聚乙二醇或氰丙基聚硅氧烷固定相。尤其是對組分較多的脂肪酸甲酯混合樣品的分離，一般選用柱長較長的脂肪酸甲酯分析專用色譜柱，如OmegawaxTM柱(聚乙二醇)和SP－2560(強極性氰丙基聚硅氧烷)等，此類柱子價格昂貴，且應用范圍較窄。本文以37種脂肪酸甲酯混標標準品為研究對象，選用30m長的Rtx－wax石英毛細管色譜柱作為分離柱，采用氣相色譜－氫火焰離子化檢測器(GC－FID)對其色譜分離條件進行選擇，最終確定了一種分離效果較好的色譜條件。在該分離條件下，選用同一根色譜柱，通過氣相色譜－質譜聯用儀(GC－MS)對37種脂肪酸甲酯做定性分析，確定了37種脂肪酸甲酯在Rtxwax色譜柱上的出峰順序。在此實驗基礎上，采用Steric and Electronic Descriptors(SEDs)表征脂肪酸甲酯的三維分子結構信息，運用SPSS(version 16.0)軟件進行逐步回歸分析，得到預測脂肪酸甲酯色譜保留時間的定量結構－色譜保留相關(QSRR)模型，同時采用留一法(Leave－One－Out，LOO)交互檢驗(Cross－Validation，CV)和外部驗證的方法對所建模型的穩定性和預測能力進行分析和驗證，均取得了較好的結果。本工作希望可以為脂肪酸的分析鑒定工作提供一條新途徑。

表1 SEDs參數名稱及其簡寫Table 1 SEDs parameter names and their abbreviations

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

37種脂肪酸甲酯混標標準品 上海安譜科學儀器有限公司;正己烷 純度≥95.0%，色譜純，天津市光復精細化工研究所。

GC/MS聯用儀 型號7890A/5975C，附FID檢測器，美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 脂肪酸甲酯混標溶液的制備 將25mg的37種脂肪酸甲酯混標標準品溶于2.00mL正己烷溶劑，在樣品瓶中密封，冷藏待用。

1.2.2 GC/MS測定條件 色譜條件:色譜柱:Rtxwax石英毛細管色譜柱(30m×0.25mm×0.5μm);進樣口溫度:250℃;柱流量:0.60mL/min;升溫程序:50℃保持2min，以5℃/min升到140℃，保持10min，再以1℃/min升到160℃，保持10min，再以1℃/min升到180℃，保持10min，再以1℃/min升到200℃，保持10min，再以1℃/min升到220℃，保持10min，然后以 2℃/min升到 230℃，保持 30min;檢測器(FID)溫度:250℃;檢測器氣體:氫氣 40mL/min，空氣450mL/min，尾吹氦氣30mL/min;進樣量:0.2μL;分流比:10∶1。

質譜條件:電子轟擊離子源;離子源溫度230℃;電子能量70eV;質量掃描范圍m/z 15～500;接口溫度為280℃，四極桿溫度為150℃。

1.3 SEDs參數計算方法

本文采用 StericandElectronicDescriptors(SEDs)參數來表征脂肪酸甲酯的分子結構信息，該參數能夠全面反映三維分子結構的大小、形狀、對稱性、拓撲特性及電荷情況等，具體的SEDs參數見表1［6－7］。SEDs 參數由能量最小的分子計算獲得，先利用ChemDraw Ultra(version 8.0)軟件勾畫脂肪酸甲酯的分子骨架，然后在Chem3D Ultra(version 8.0)軟件中，采用MM2方法和MOPAC軟件包進行分子最小能量優化，最后計算出37種脂肪酸甲酯的 SEDs參數。

2 結果與討論

2.1 氣相色譜分離條件的選擇

由于待分離的37種脂肪酸甲酯存在多種異構體，在選擇色譜柱時，應綜合考慮脂肪酸甲酯的碳原子數、不飽和度以及雙鍵的位置等多個因素。對于同分異構體及碳數相同、雙鍵個數不同的物質，在非極性柱上很難分開;另外考慮到脂肪酸甲酯分析專用柱多為極性固定相，因此，本實驗選用強極性的Rtx－wax(聚乙二醇)色譜柱分離37種脂肪酸甲酯。又由于待分離的37種物質，沸程較寬，且有些化合物的沸點比較接近，故采取多步程序升溫的方法，且升溫速率盡量小，以便沸點接近的化合物能夠很好的分離;同時對載氣流速進行考察，最終確定的同時分離37種脂肪酸甲酯的色譜條件如1.2.2節中所述，在此條件下，達到了較好的分離效果，且峰形較好。得到的37種脂肪酸甲酯的氣相色譜圖見圖1。

2.2 SEDs參數與脂肪酸甲酯氣相色譜保留時間的相關性研究

2.2.1 模型建立 本文中用于建模的37個脂肪酸甲酯的氣相色譜保留時間均來自于筆者實驗所得。

首先計算出37個樣本的SEDs參數，借助多元線性回歸(MLR)方法對37個脂肪酸甲酯的SEDs參數和tR(exp)進行相關性研究，采用SPSS(version 16.0)軟件進行逐步回歸分析，篩選出最優變量。建立定量結構－保留關系(QSRR)模型，采用留一法(LOO)交互檢驗(CV)對所建模型進行驗證，觀察模型相關系數(R)、標準偏差(SD)、留一法(Leave－One－Out，LOO)交互檢驗相關系數(RCV)、標準偏差(SDCV)隨引入變量數的增加而變化的情況。為控制模型穩定性和消除變量間共線性的影響，對每步變量進行方差膨脹因子(VIF)［8］計算。VIF=(1－R2)－1，式中 R為某自變量與其它變量相關程度(經自由度校正)。VIF值為1.0，表示各變量間無相關性;VIF值在1.0～10.0之間，表示變量間無明顯共線性，相關方程可接受。逐步回歸分析及變量膨脹因子(VIF)計算結果見表2。

圖1 37種脂肪酸甲酯的氣相色譜圖Fig.1 GC chromatogram of 37 fatty acid methyl esters

從表2中可以看出，逐步回歸分析中，當選用變量 TVcon、SVDe、Windex、Bindex、MW 建模時，相關系數R最大，標準偏差SD最小;且留一法交互檢驗過程中，同樣是選入變量 TVcon、SVDe、Windex、Bindex、MW建模時，RCV值最大，SDCV值最小。而為了保證模型穩定性及消除變量共線性，要求模型中各變量VIF不大于10，滿足這一條件的有模型2和模型6，其中模型2中的R、SD、RCV和SDCV均較大，綜合分析，最終以模型6為最佳模型。所見QSRR模型如M1:

交互檢驗:RCV=0.9951，SDCV=4.9251，FCV=789.1953

其中，N為回歸樣本數，m為變量個數，R為相關系數，SD 為標準誤差，F為 Fisher檢驗值，RCV、SDCV、FCV分別為留一法交互檢驗的相關系數、標準誤差和Fisher檢驗值。

模型M1的相關系數R=0.9990，留一法(LOO)交互檢驗(CV)的相關系數RCV=0.9951，與建模時的相關系數R很接近，二者均接近1，說明所建模型的穩定性較好［9］。建模時引入的變量參數及保留時間見表3。另外使用模型M1對37種脂肪酸甲酯的氣相色譜保留時間進行預測，并將預測值對實驗值的相關情況及殘差分布散點圖分別繪于圖2、圖3中。

圖2 MLR模型預測值、留一法交互檢驗預測值與實驗值相關性Fig.2 Plot of estimated values，observed ones of Leave－One－Out，LOO and observed ones

圖3 MLR模型預測值、留一法交互檢驗預測值的誤差分布Fig.3 Plot of Err EST vs.N

從圖2中可以看出，模型預測值與實驗值符合的較好，留一法交互檢驗的預測值與實驗值的線性相關性較好，具體表現為圖2中樣本均勻分布在過原點的45°直線周圍。圖3顯示，模型預測值誤差大多數點均勻分布在±2SD之間，留一法交互檢驗預測值誤差基本上均勻分布在±2SDCV之間。

表2 逐步回歸及變量膨脹因子值Table 2 The results of stepwise regression and VIF

表3 模型中引入的變量及37種脂肪酸甲酯保留時間(tR)的實驗值、預測值Table 3 The introduced variables and observed values and predicted ones of 32 kinds of fatty acid methyl esters

2.2.2 模型驗證 在定量構效關系的研究中，對所建模型的外部預測能力和真實有效性進行驗證是非常重要的一部分。目前廣泛使用的一種模型驗證方法是留一法(LOO)交互檢驗(CV)。然而Tropsha等人［10］的研究結果表明:模型的外部預測能力與RCV值的大小并沒有明顯的相關性，而是采用外部樣本(即測試集)預測值的相關系數Q2ext來衡量:

式中:yi為測試集中樣本的實驗值;ˉyi為測試集樣本的預測值;ˉytr為訓練集樣本實驗值的平均值。

為了驗證模型對外部樣本的預測能力，將上述37個樣本分為兩組，按照大約三分之一的樣本作為測試集，大約三分之二作為訓練集，從第一號樣本開始，每隔2個取一個樣本作為測試集，這樣得到25個樣本作為訓練集(Training Set)，12個樣本作為測試集(Test Set)。測試集樣本在表3中用“*”號標出。對訓練集中的25個樣本建模，采用逐步回歸進行變量篩選，結合變量的方差膨脹因子VIF值，篩選出四個最優變量(TVcon、SVDe、Windex、Bindex)，借助多元線性回歸建立如下QSRR模型(M2):

交 互 檢 驗:RCV=0.9943，SDCV=5.5598，FCV=433.1412

采用上述12個外部樣本(測試集)對所建模型的外部預測能力進行檢驗，利用公式(1)計算得到=0.9995，進一步表明模型具有良好的穩定性和預測能力。

2.2.3 模型分析 脂肪酸甲酯的定量結構－色譜保留相關模型如M1所示。該模型中引進的四個變量分別為 Windex、Bindex、SVDe、TVcon。由此可知該類型脂肪酸甲酯的氣相色譜保留時間與 Windex、Bindex、SVDe、TVcon 有關。

Windex指數是分子骨架中各碳原子間距離總和，其值隨分子的增大而增加，隨分子的支化程度增加而減小。Windex值的大小反映了溶質分子與固定相作用時色散力強弱的信息。Windex值越大，溶質與固定相之間的色散力越大，保留時間越長，即Windex與脂肪酸甲酯的氣相色譜保留時間呈正相關。

Bindex指數是建立在分子圖的距離矩陣基礎上而構造產生的，對不飽和鍵給予區分，反映了分子的大小和形狀等結構信息［11］。從表3中可見，隨著碳數的增多保留時間基本呈上升趨勢，其原因是溶質分子碳原子數越多，與固定相接觸面積越大，色散力越大;當碳鏈相同時，Bindex值是相同的，但保留時間卻隨著飽和度的增大而增大。其原因可能是在不飽和程度增大的過程中，雖然極化力和誘導力是增大的，但因C=C相對于C－C來說，鍵長縮短，導致色散力減小。綜合多種因素的共同影響，模型中Bindex系數為負值是可以理解的。

SVDe為溶質分子中所有原子點價之和［12］，包含了溶質分子與固定相作用時色散力和誘導力的信息，溶質分子色譜保留時間隨其SVDe值的增大而增大，這與模型中SVDe的系數為正值是一致的。

TVCon 反映分子的電子結構信息［13－15］。TVCon值越小，表明分子不飽和度越大，誘導力和取向力隨之增大，溶質分子的色譜保留時間也就越長。模型中，TVCon系數最小，表明TVCon對脂肪酸甲酯的色譜保留時間貢獻較小，并不是主要的影響因素。

在所建模型M1中，Windex系數最大，說明該極性固定相上，分子體積對脂肪酸甲酯化合物色譜保留時間的影響起主要貢獻。1、2、3號化合物由于結構簡單，分子體積小，在極性固定相上的誤差較大是正常的。

3 結論

對于37種脂肪酸甲酯的分離，通常使用脂肪酸甲酯分析專業色譜柱，這類色譜柱價格昂貴，普通實驗室不易實現。本工作選用30m長的Rtx－wax石英毛細管色譜柱，就能對37種脂肪酸甲酯取得較好的分離效果。Rtx－wax在一定程度上可以取代脂肪酸甲酯分析專用色譜柱，避免使用價格昂貴脂肪酸甲酯分析專用色譜柱，大大節約了實驗成本，實際應用性較強。QSRR研究結果表明，SEDs參數可以較好地表征脂肪酸甲酯類化合物的分子結構特征，采用SEDs建立的QSRR模型具有較好的穩定性和預測能力，可以較好地預測該類化合物的氣相色譜保留時間，該方法為植物油脂中脂肪酸的分析工作提供了一定的理論依據。

［1］劉飛.氣相色譜法同時測定食品中34種脂肪酸［J］.福建分析測試，2010，19(3):15－20.

［2］李丹華，朱圣陶.氣相色譜法測定常見植物油中脂肪酸［J］.糧食與油脂，2006(8):46－48.

［3］楊培慧，鄭志雯，趙秋香，等.食用植物油脂肪酸的高分辨氣相色譜分析［J］.中國油脂，2003，28(7):48－50.

［4］李高陽，丁霄霖.亞麻籽油中脂肪酸成分的GC－MS分析［J］.食品與機械，2005，21(5):30－32.

［5］何志勇，夏文水.兩種不同橄欖核仁油中脂肪酸組成的GC/MS 分析［J］.食品科學，2006，27(3):188－190.

［6］劉曉華，高子燊，王連生，等.多氯聯苯的氣相色譜相對保留時間和理化性質預測模型［J］.環境化學，2007，26(2):184－191.

［7］李小林，荊國華，周作明，等.多環芳烴沸點和辛醇/水分配系數的 QSPR研究［J］.計算機與應用化學，2010，27(4):528－532.

［8］Sutter J M，Peterson T A，Jurs P C.Prediction of gas chromatographic retention indices of alkylbenzenes［J］.Analytica Chimica Acta，1997，342:113－122.

［9］Nakajima N，Lay C，Du H B，et al.Prediction of gas chromatographic retention times of carbazolesin light cycle oil［J］.Energy Fuels，2006，20(3):1111－1117.

［10］Tropsha A，Gramatica P，Gombar V K.The importance of being earnest:Validation is the absolute essential for successful application and interpretation ofQSPR models［J］.QSAR＆Combinatorial Science，2003，22(1):69－77.

［11］孟繁宗.不飽和烴的QSPR研究［J］.計算機與應用化學，2004，21(4):645－649.

［12］Kier L B，Hall L H.Molecular Connectivity in Chemistry and Drug Research［M］.New York:Academic Press，1976:18.

［13］Hall L H，Kier L B.Issues in representation of molecular structure－The development of molecular connectivity［J］.Journal of Molecular Graphics and Modelling，2001，20:4－18.

［14］Mu L L，He H M.QSPR study of standard absolute entropies for gaseous organic compounds using novel molecular connectivity indexes and Ring parameter［J］.Thermochimica Acta，2011，526:99－106.

［15］Vyas V K，Joshi G，Namdeo B，et al.Exploring structure indenture of some aminopyrazolopyridine ureas as potent VEGFR/PDGFR multiargeted kinase inhibitors:A QSAR approach［J］.Indian Journal of Chemistry，2011，50(B):858－867.