殺鈴脲緩釋微膠囊制備表征及緩釋性能的研究

宇 佳，關樺楠，田 可，李曉燦，嚴俊鑫，遲德富，*

(1.東北林業大學林學院，黑龍江哈爾濱150040;2.哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江哈爾濱150076;3.東北林業大學園林學院，黑龍江哈爾濱150040)

由于傳統農藥劑型的有效利用率低，流失率高，不僅在經濟上造成浪費，同時造成大面積的環境污染，對食品的安全也構成很大威脅，因此農藥新劑型的開發一直被視為國內外的研究熱點［1］。將微膠囊技術引入農藥劑型的改良，利用新技術制備農藥核殼結構的新劑型，已成為新型農藥研制的一個發展趨勢［2－3］。微膠囊技術是利用天然或合成的高分子材料將固體或液體物質包埋起來，形成具有半通透性或密封囊膜的微型膠囊技術［4］。該技術通過密閉的或半透性的壁膜將活性物質與周圍環境隔離開來，從而達到保護和穩定芯材、屏蔽氣味或顏色、控制釋放芯材等目的［5－7］。層層自組裝技術(Layer－by－Layer，LbL)是近年來發展起來的新自組裝技術，該技術的主要特點是在荷電的基材表面通過靜電相互作用交替地吸附上帶相反電荷的聚電解質離子。利用該技術制備新型微膠囊能夠提高藥物包封率，控制藥物釋放速度，而且工藝較為簡單［8－10］。但是，目前利用這個技術對農藥的微膠囊制備的報道很少。周斌等［11］使用殼聚糖和木質素磺酸鈉，通過層層自組裝技術成功地對阿維菌素進行微膠囊化，包封率達70%以上。殺鈴脲((Triflumuron，TFM))是一種苯甲酰脲類殺蟲劑，對昆蟲具有胃毒和觸殺作用，殺鈴脲能夠抑制幼蟲表皮幾丁質的合成，影響蛻皮過程，使蟲體畸形而死亡。對成蟲有不育作用，使之產卵量減少，降低卵的孵化率。對控制鱗翅目、鞘翅目、雙翅目等多種害蟲幼蟲效果明顯［12－13］。本研究采用殼聚糖(Chitosan，CHI)和海藻酸鈉(Sodium alginate，ALG)為囊壁材料，利用靜電吸附層層自組裝技術(LbL)制備殺鈴脲微膠囊，運用正交實驗優化其制備工藝，研究其緩釋性能，以期為殺鈴脲及類似農藥微膠囊的制備和應用及農藥性能的改良和新劑型的開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

殺鈴脲(純度＞95%)美國陶氏益農公司;殺鈴脲標準品(純度99.9%)Sigma公司;殼聚糖 分析純，浙江金殼生物化學有限公司;海藻酸鈉 化學純，北京旭東化工廠;其余試劑均為分析純且產自上?；瘜W試劑公司。

熒光分光光度計 Cary Eclipse，VARIAN;液相色譜儀 HP1000，美國安捷倫公司;Zeta電位儀 FPA，上海普利賽斯國際貿易有限公司;激光共聚焦顯微鏡 FV300，Olympus Corporation;掃描電子顯微鏡Quanta－200，FEI Company;激光粒度儀 BT－9300H，成都貝斯達儀器儀表廠等。

1.2 殺鈴脲重結晶及微膠囊制備方法

取殺鈴脲原藥0.5g溶解于20mL丙酮中，勻速攪拌20min，將含有0.01g穩定劑—羥丙基甲基纖維素(HPMC)的50mL去離子水溶液快速倒入20mL殺鈴脲溶液中，勻速攪拌3h，離心，將沉淀用去離子水清洗3遍，冷凍干燥，即得到殺鈴脲重結晶晶體。

取重結晶后的殺鈴脲晶體置于2mL離心管中;加入1mL的殼聚糖溶液，在旋渦振蕩器上混勻，超聲振蕩5min，每隔1～2min搖勻30s;10000r/min離心4min，棄上清，加入1mL去離子水洗滌并離心，棄上清。再加入1mL海藻酸鈉溶液，在旋渦振蕩器上振蕩混勻，超聲振蕩 5min，每隔 1～2min搖勻 30s;10000r/min離心4min，棄上清，加入1mL去離子水洗滌并離心，棄上清，得到1個雙層(海藻酸鈉和殼聚糖)包覆的殺鈴脲微膠囊;重復上述步驟，即可得到3個和5個雙層包覆的微膠囊;最后用1mL的CaCl2溶液滴定，交聯撫育1h，8000r/min離心3min，用去離子水清洗沉淀2遍，干燥獲得樣品。

1.3 正交優化殺鈴脲微膠囊制備體系

選取海藻酸鈉濃度(W/V)、殼聚糖濃度(W/V)、殺鈴脲濃度(W/V)和CaCl2濃度(W/V)為影響因素，每個因素選擇3個水平，以L9(34)正交表設計實驗，考察復合因子對包覆5個雙層(CHI/ALG)殺鈴脲微膠囊效果的影響。

利用高效液相色譜測定殺鈴脲的濃度，液相條件:流動相甲醇∶水(體積比41∶59);柱溫為30℃;檢測波長254nm;進樣體積 10μL［14］。正交實驗設計見表 1。重復3次，測定微膠囊最終的包封率和載藥量。

1.4 殺鈴脲微膠囊的表征與評定

將1mL濃度為1g/L微膠囊分散液加入到激光粒度儀分散池中，測試微膠囊的粒徑分布。采用激光共聚焦顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察微膠囊的整體分布和表面形貌。利用Zeta電位儀測定微膠囊的Zeta電勢。

表1 正交設計因素水平表Table 1 The table of the factor level in orthogonal design

微膠囊化的效果用微膠囊包封率(EE)(即包裹在微膠囊中殺鈴脲與體系中加入的殺鈴脲質量比)和微膠囊載藥量(DL)(即單位質量微膠囊中含有的殺鈴脲質量)來評定。按照下面公式計算殺鈴脲的包封率與載藥量:

m為加入反應體系的殺鈴脲質量，m1為殺鈴脲微膠囊凍干后的質量;m2為微膠囊中所包覆的殺鈴脲的質量(將微膠囊凍干產物溶解在甲醇中，萃取殺鈴脲，高效液相色譜法測定殺鈴脲的濃度)。

1.5 殺鈴脲微膠囊的模擬體外釋放研究

取50mg殺鈴脲原藥和包覆1、3、5個雙層的殺鈴脲微膠囊，分別懸浮在2mL的磷酸緩沖液(pH7.4)中;取100μL的懸浮液注入到盛有3mL磷酸緩沖液(pH7.4)的比色皿中，25℃(模擬昆蟲體內環境條件)勻速攪拌;以30min的時間間隔，在418nm最大發射波長作為檢測波長，通過檢測熒光強度隨釋放時間的變化研究不同囊壁層數殺鈴脲微膠囊的釋放性能。

2 結果與分析

2.1 殺鈴脲微膠囊的重結晶樣品結構分析

殺鈴脲原藥的表面不規則，晶體粗糙，不適宜直接進行電荷的沉積，通過重結晶技術，得到的晶體大小均一、粒徑分布比較緊致、表面光滑規則，且較大幅度地降低了殺鈴脲的表面能，有利于電荷沉積(見圖1)。Zeta電位顯示為負電，能夠進行靜電吸附層層自組裝。

2.2 制備工藝的正交優化

按正交設計表L9(34)進行實驗，用極差分析法對實驗結果做直觀分析。由表2極差大小可看出，影響因素的主次順序為B＞C＞A＞D，即殼聚糖的濃度對包埋微膠囊效果產生最顯著的影響，海藻酸鈉與殺鈴脲的濃度為影響體系的次要因素，CaCl2的濃度對體系影響較小。根據K值大小，選擇最佳因素水平為A3B3C1D3，按照A3B3C1D3的工藝條件，在相同實驗條件下，同一實驗人員重復3次制備殺鈴脲微膠囊，所得殺鈴脲微膠囊的包封率和載藥量分別為71.1% ±0.51%和67.4% ±0.33%，而按照A3B2C1D3條件制備的殺鈴脲微膠囊的包封率和載藥量分別為77.4%和75.2%，均高于A3B3C1D3條件組合。因此最終確定最佳因素水平為A3B2C1D3，工藝條件為:3.0g/L海藻酸鈉，2.0g/L殼聚糖，1.0g/L殺鈴脲和2.0g/L CaCl2。利用激光粒度儀測定微膠囊的粒徑分布，得出殺鈴脲微膠囊粒徑基本呈正態分布，平均粒徑為6μm。

表2 殺鈴脲微膠囊制備工藝正交實驗結果Table 2 Orthogonal array design layout and experimental results

圖1 重結晶后的殺鈴脲激光共聚焦顯微鏡圖片Fig.1 The CLSM images of triflumuron after recrystallization

2.3 殺鈴脲微膠囊的表征

根據正交實驗獲得的最佳制備工藝，制備不同層數的殺鈴脲微膠囊。利用激光共聚焦顯微鏡和掃描電子顯微鏡對5個雙層微膠囊(CHI/ALG)5的微觀結構和整體分布進行表征。

在激光共聚焦顯微鏡下觀察(CHI/ALG)5殺鈴脲微膠囊的外觀形態(如圖2A)所示復合微膠囊晶體形狀良好，表面光滑，分散性好。由圖2B可見，在晶體邊緣處可以清晰地看到殺鈴脲微膠囊表面覆蓋著的囊壁材料。表面平整、規則，沒有藥物溶出，表明藥物被包被其中。

通過Zeta電位儀觀察不同組裝次數的微膠囊電勢，如圖3所示，包裹之前殺鈴脲表面電位大約為－12.5mV。吸附殼聚糖后，殺鈴脲表面的電位值大約是+15mV，說明其表面被帶正電的殼聚糖所覆蓋;吸附海藻酸鈉后，殺鈴脲表面的電位值大約是－15mV，說明其表面被帶負電荷的海藻酸鈉所覆蓋，電位交替發生正負變化，說明海藻酸鈉與殼聚糖能夠交替沉積到殺鈴脲上，成功制備出了載有殺鈴脲的微膠囊。

圖2 (CHI/ALG)5的殺鈴脲微膠囊Fig.2 TFM microcapsules(CHI/ALG)5

圖3 殺鈴脲微膠囊電勢變化Fig.3 Potential variation of TFM microcapsules

2.4 殺鈴脲微膠囊的模擬體外釋放研究

利用熒光分光光度計監測殺鈴脲原藥與多層微膠囊在模擬昆蟲中腸內環境條件下(pH7.4，T=25℃)釋放行為。通過研究微膠囊的釋放比例來確定最終的釋放率［15］。

與原藥相比，多層包被的殺鈴脲微膠囊具有明顯的緩釋效應。其釋放可分為前期快速階段和中后期穩定釋放階段。前期藥物釋放過快，主要是由于壁材表層及淺層存有部分殘留的殺鈴脲，導致了初期殺鈴脲的釋放量較大，這與文獻報道的藥物微膠囊在釋放初期的“突釋效應”相符［16］。

由微膠囊釋放動力學曲線可知:1個雙層的殺鈴脲微膠囊沒有明顯的緩釋作用，殺鈴脲釋放率是隨著微膠囊的包覆層數的增加而下降。這與Ibarz等［17］人的研究:多層聚電解質微膠囊囊壁厚度可以決定其釋放行為的結論相符。說明包被不同層數的殺鈴脲微膠囊具有明顯的緩釋性能，而且可通過控制農藥微膠囊的包覆層數來控制農藥的釋放率。

圖4 殺鈴脲微膠囊的釋藥動力學曲線Fig.4 Release kinetics curves of TFM microcapsules

3 結論

以海藻酸鈉和殼聚糖為壁材，采用層層自組裝技術(LbL)制備了具有緩釋性能的殺鈴脲微膠囊。通過優化篩選出最優制備條件為:3.0g/L海藻酸鈉，2.0g/L殼聚糖，1.0g/L殺鈴脲和2.0g/L CaCl2，其中，殼聚糖的濃度對包埋微膠囊效果影響最大。最大的殺鈴脲微膠囊最大的包封率和載藥量分別為77.4%和75.2%;通過激光共聚焦顯微鏡(CLSM)與掃描電鏡(SEM)對殺鈴脲微膠囊進行表征，晶體形狀良好，表面光滑，沒有藥物溶出，平均粒徑為6μm，Zeta電位為－12.5mV，通過體外緩釋性能實驗，殺鈴脲微膠囊具有明顯的緩釋效應，而且隨著包覆層數的增加緩釋性能增強。因此，可以通過調節囊壁材料的包覆層數實現對農藥的可控釋放。

［1］華乃震.農藥新劑型進展和動向［M］.中國植物病害化學防治研究(第1卷)北京:中國農業科技出版社，1998:34－43.

［2］楊淑珍.農藥緩釋劑研究進展［J］.山東農業科學，2012，40(2):186－188.

［3］張青，楊代鳳，周新偉，等.2.5%高效氯氟氰菊酯不同劑型防治水稻害蟲效果比較［J］.江蘇農業科學，2006(4):41－42.

［4］王延圣，蘇平.微膠囊技術在植物精油中的應用及研究進展［J］.食品工業科技，2012，33(10):453－456.

［5］Yuan L，Guo ZL，Xie JQ，et al.The permeability and stability of microencapsulated epoxy resins［J］.Journal of Materials Science，2007，12(42):4390－4397.

［6］Otero C，Robledo L.Two alternatives:Lipase and/or microcapsule engineering to improve the activity and stability of Pseudomonas sp.and Candida rugosa lipases in anionic micelles［J］.Progress in Colloid ＆ Polymer Science，1996，100:296－300.

［7］Oh A，Yun J.Controlled release behavior of PCL/PEO/activated carbon composite microcapsule［J］.Journal of Polymer Research，2011，6(8):2441－2447.

［8］林紅艷，曾珊珊，王燕梅，等.溶菌酶與羧甲基纖維素層層自組裝印跡聚合物［J］.武漢理工大學學報，2012，35(2):48－52.

［9］彭湘紅，王敏娟，周菊香，等.組裝法制備殼聚糖/羥基磷灰石/海藻酸復合膜及其性能測定［J］.江漢大學學報:自然科學版，2008(2):48－51.

［10］林全愧，計劍，譚慶剛，等.層層自組裝技術在生物醫用材料領域中的應用研究進展［J］.高分子通報，2006(8):15－19.

［11］周斌，趙靜.層層自組裝制備阿維菌素微膠囊及其釋藥行為［J］.精細化工，2008，25(7):625－627.

［12］Li Chen，Qingmin Wang，Runqiu Huang，et al.Synthesis and insecticidal evaluation of propesticides of Benzoylp henylureas［J］.J.Agriculture Food Chemistry，2005，53(1):38－41.

［13］梁英，賀紅武，楊自文，等.苯甲酰脲類化合物研究開發進展［J］.農藥，2009，48(9):625－628.

［14］石相梅.高效液相色譜法測定水和廢水中的煙嘧磺隆、吡嘧磺隆、噻嗪酮、氟蟲氰［J］.污染防治技術，2009，22(4):89－92.

［15］馬艷，岳秀麗，馬放，等.新型喜樹堿緩釋微膠囊的制備［J］.哈爾濱工業大學學報，2009，41(4):48－50.

［16］Jegat C，Taverdet L J.Stirring speed influence study on the microencapsulation process and on the drug release from microcapsules［J］.Polym Bull，2000，44(3):345－351.

［17］Ibarz G，Dahne L，Donath E，etal.Resealing of polyelectrolyte capsules after core removal［J］.Macromolecular Rapid Communications，2002，23(8):474－487.