應用SRAP標記對六個灰樹花的多態性分析

尹永剛，胡汝曉，李新菊，王春暉，彭運祥

(湖南省食用菌研究所，湖南長沙410013)

灰樹花(Grifola frondosa(Fr.)Gray)又稱栗蘑、千佛菌、貝葉多孔菌、舞茸，是一種珍貴的大型食藥用真菌。野生灰樹花大多發生在板栗、櫟樹、栲樹等殼斗科樹種及闊葉樹樹樁基部或倒腐的近地樹干上，是一種典型的白腐菌，以分解樹木的心材為營養，造成樹木心材腐朽［1］，其姿態優美，香氣濃郁，味道鮮美，柔軟脆嫩，子實體富含蛋白質、纖維、維生素，是一種深受人民喜愛的營養保健食品［2］，在藥用價值上具有抗腫瘤、免疫刺激、抗血栓、抗菌、抗病毒、抗糖尿病、抗氧化及增強生命力等多重功效［3］。目前國內外關于灰樹花的研究報道主要集中在栽培技術和生物活性物質成分與功能研究［3－4］等方面，而關于該菌種的分子生物學研究報道較少。由于目前國內生產上菌種管理混亂，以及認識上的混亂致使“同名異物、同物異名”的現象普遍存在，給科研帶來許多不必要的重復，也阻礙了菌種的調劑供給。由于技術上的復雜性，傳統的鑒定方法如拮抗、同工酶分子等技術已經跟不上科技的發展，而標記技術的出現大大的降低了解決這一問題的困難。序列相關擴增多態性(Sequence－related amplified polymorphic，SRAP)標記技術是2001年由Li和Quiros開發出的一種新型的基于PCR的標記系統［5］。該標記是通過獨特的引物設計對ORFs(Open Reading Frames)進行擴增。上游引物長17bp，下游引物長18bp，對內含子區域、啟動子區域進行特異擴增［6］。因不同個體、物種的內含子、啟動子及間隔區長度不同而產生多態性。該標記具有檢測簡單，重復性好，每對引物都能夠產生適度的多態性標記，而且其中一部分是共顯性標記，能夠比較容易地分離目的標記并測序等［7］。目前SRAP標記已經在香菇 (Lentinula edodes)［8］、黑 木 耳 (Auricularia auricula)［9］、毛木耳(Auricularia polytricha)［10］、榆黃蘑(Pleurotus citrinopileatus)［11］、 平 菇 (Pleurotus ostreatus)［12］等食用菌上有研究報道。本研究將采用SRAP方法對6個灰樹花栽培品種進行遺傳關系分析，探討不同灰樹花的親緣關系及該分子標記的多態性分析等問題，并準確地對灰樹花菌種進行遺傳分類，為灰樹花種植資源的遺傳多樣性和灰樹花育種親本選配研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

灰樹花(Gf1) 湖南省食用菌研究所;灰樹花－1(Gf2)北京市農林科學院;灰樹花3號(Gf3)、灰樹花5號(Gf4)、灰樹花53號(Gf5)三明真菌研究所;灰樹花15(Gf6)浙江慶元;植物基因組DNA提取試劑盒 北京天根生化公司;瓊脂糖 西班牙Biowest公司;Taq buffer(Mg2+)、dNTPs、Taq DNA 聚合酶 大連寶生物工程有限公司;葡萄糖、MgSO4、KH2PO4、蛋白胨 國藥集團化學試劑有限公司，分析純;引物 上海生工生物工程有限公司;溴化乙腚美國Sigma公司;1Kb Plus DNA Ladder 北京中科瑞泰生物公司。

電泳儀JY600C 北京君意東方電泳設備有限公司;HYG－A型恒溫振蕩搖瓶柜 太倉市實驗設備廠;Eppendorf 5415R臺式冷凍離心機 德國Eppendorf公司;Eppendorf Mastercycler gradient PCR儀 德國Eppendorf公司;Bio－Rad凝膠成像系統美國Bio－Rad公司;Thermo精密綜合培養箱、Thermo生物安全柜 美國Thermo公司;Bullet Blender高通量組織研磨儀 美國Next Advance公司。

1.2 菌絲體培養和基因組DNA提取

將供試菌株分別接種于PDA液體綜合培養基(馬鈴薯 200g，葡萄糖 20g，MgSO41.5g，KH2PO43g，VB10.01g，蛋白胨5g，加水定容至1L)中，置于25℃振蕩培養箱中，130r/min條件下恒溫培養10d。菌絲體基因組DNA采用植物基因組DNA提取試劑盒提取。

1.3 引物與PCR擴增

SRAP－PCR擴增體系:10×Taq buffer(含Mg2+)5μL，2.5mmol/LdNTPs 1μL，20μmol 引 物 2μL，5U/μL Taq DNA 聚合酶 0.5μL，基因組 DNA 模板1μL(約50ng)，ddH2O 補足50μL。反應程序為:94℃5min;94℃ 1min，35℃ 1min，72℃ 1min，5 個循環;94℃ 1min，50℃ 1min，72℃ 1min，35 個循環;72℃10min，4℃保存。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色后拍照記錄。

1.4 數據分析

對獲得的電泳圖譜進行條帶統計，有帶的地方記為1，無帶的地方記為0，用Excel軟件將原始數據轉換成0/1矩陣;用NTSYS pc2.10軟件進行數據分析，對原始矩陣用SIMQUAL程序求Jaccard相似系數矩陣，并獲得相似系數矩陣，用SHAN程序中的UPGMA方法進行聚類分析，并通過Tree Plot模塊生成親緣關系聚類圖。

2 結果與討論

2.1 SRAP分析

對6株灰樹花的基因組DNA進行SRAP－PCR的統計分析(表1)，14對引物組合共擴增出151條位點片段，其中多態性片段132條，占總片段條數的87.4%，多態性整體較高。每對引物組合擴增條帶數在7～16條之間，其中引物組合me3/em13(圖1－A)擴增帶數最少，為7條，引物組合me5/em6(圖1－B)擴增帶數最多，為16條。獲得多態性百分比最高的引物組合為 me1/em15(圖1－D)和 me3/em13，均獲得100%的多態性片段，而引物組合me2/em3(圖1－C)擴增得到的多態性片段比例最低，為62.5%。

本研究所得的擴增帶譜讀取結果計算6株灰樹花菌株之間的Jaccard相似系數，變化范圍為0.3019～0.7662，其中Gf5和Gf6相似系數最高，親緣關系最近，Gf2和Gf4遺傳關系最遠。應用UPGMA法聚類，構建了6株灰樹花菌株的SRAP聚類圖(圖2)。對供試菌株在相似系數躍變處進行分類。在相似系數為0.45處取一結合線，供試6個菌株被分為3個小組，第一小組為Gf1;第二小組:Gf2和Gf3;第三小組為Gf4、Gf5和Gf6。由此可知，來自不同地區的灰樹花栽培品種可能在引種來源上有交叉，其中Gf1來自湖南，被聚為一類。而另一株來自北京的Gf2同來福建的Gf3聚為一類，但親緣關系較遠;另外兩株來自福建三明真菌研究所的Gf4和Gf5與浙江的Gf6聚為一類，其中Gf5和Gf6最初可能源于同一地區。

表1 SRAP引物對灰樹花DNA擴增條帶的多態性分析Table 1 Polymorphism analysis of the amplified bands of Grifola frondosa genomic DNA generated by SRAP primers

圖1 引物組合 me3/em13、me5/em6、me2/em3、me1/em15分別對6株灰樹花的擴增圖譜Fig.1 Fingerprints of 6 Grifola frondosa strains generated by the primer combinations of me3/em13，me5/em6，me2/em3 and me1/em15，respectively

圖2 灰樹花菌株的SRAP聚類圖Fig.2 The dendrogram of Grifola frondosa strains with SRAP method

王守現等［13］采用酯酶同工酶、RAPD和ISSR方法對北京地區的6個灰樹花菌株進行綜合分析，證明可以將6個菌株進行分類，但在該研究報道的不足之處在于，在RAPD和ISSR方法上，分別僅使用了2個RAPD引物和1個ISSR引物，因此對于菌株間的多樣性分析會因為產生誤差較大而導致結果不夠準確。近年來，研究學者們利用SRAP技術對香菇、木耳、平菇［8－9，12］多樣性評價時，都可以將種內的多個品種明顯地區分開來，并達到分類的效果。Du等［10］應用SRAP技術對云南地區的毛木耳野生品種同四川與河南地區的栽培品種進行遺傳多樣性分析，在不同野生品種存在多樣性的同時，可將野生品種與栽培品種進行區分，這與地理上位置的差異是一致的，同時也表明河南與四川地區的栽培菌可能引源于同一地區。越來越多的研究者將分子標記技術應用于食用真菌，如杏鮑菇、雙孢蘑菇和香菇等［14－16］的種間和種內不同菌株的鑒定研究。分子標記手段較多，因此研究中同時采取多種分子標記比較分析的方法，比如 ISSR［17］、AFLP［18－19］、SSR［20－21］等分子技術手段，對物種進行親緣關系和多樣性研究，是今后工作研究的重點。

3 結論

灰樹花具有獨特的食用價值與藥用價值，是近年來被越來越多的消費者喜愛的珍稀食用菌品種，因此，對于該品種遺傳學及育種方面的研究，是今后工作的重點。分子標記通常以個體間遺傳物質內核酸序列的變異為基礎，在DNA水平上直接的反映出個體間的遺傳多態性，因此，在遺傳育種、基因組作圖、物種親緣關系鑒定、基因克隆等方面有廣泛應用。SRAP是分子標記的手段之一，本研究采用該技術對湖南、北京、浙江和福建地區的6個灰樹花栽培品種進行了親緣關系與多態性分析，14對SRAP引物組合共擴增出151條位點片段，其中多態性片段132條，占總片段條數的87.4%，菌株間相似系數變化范圍為0.3019～0.7662，同時將6個菌株分為3大類，結果表明SRAP技術能夠在分子水平上分析供試菌株之間的親緣關系，并且能有效的把不同的菌株區分開來，這也為今后優良灰樹花品種的選育工作提供了有效的參考。

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