樟樹葉多酚提取物體外清除自由基及抗油脂氧化活性研究

付湘晉，王 揮，冉曉敏，陳 浪，李忠海，黎繼烈

(中南林業科技大學食品科學與工程學院，湖南長沙410004)

樟樹(Cinnamomum camphora(L.)Presl.)系樟樹屬的常綠喬木植物，是中國亞熱帶綠闊葉林的主要樹種之一，在中國資源非常豐富［1］。從古至今，中國就有利用樟樹的木、葉、根等治病的歷史，中醫認為樟樹有祛風除濕、行氣止痛、活血化瘀、通利關節之功效［2］。中國是世界上生產芳樟油最多的國家，其產量占世界的80%。芳樟油主要以樟樹枝葉為原料，采用蒸餾法生產，由于樟樹枝葉中芳樟油含量只有3%左右［3］，所以有大量加工下腳料未被利用。樟樹葉除含有芳樟油以外，還含多酚、類胡蘿卜素、多糖、生物堿等多種生物活性物質［4］。所以，提取芳樟油后的下腳料是提取這些活性物質易得的低成本原料。酚類化合物作為一種天然的抗氧化劑，具有很強的抗氧化作用，其健康功效包括抗衰老、強化血管壁、促進消化、降低血脂肪、增加身體抵抗力、防止動脈硬化、血栓形成、利尿、降血壓、抑制細菌與癌細胞生長等等，近年來，頗受研究者重視，被稱為“第七類營養素”。以天然抗氧化劑取代合成抗氧化劑是食品行業的發展趨勢，從天然植物中尋找新的清除體內自由基的抗氧化劑也將是現代醫藥、保健行業的發展方向?，F已有較多的植物源天然抗氧化劑被作為添加劑應用于食品工業中，如茶多酚顯著抑制魚肉的脂肪氧化［5］。本實驗室前期研究發現樟樹葉含有大量酚類物質，是新的多酚資源［6］。本文進一步研究了樟樹葉多酚體外清除自由基及抗油脂氧化活性，為樟樹葉多酚資源的利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樟樹葉 2010年9月于中南林業科技大學校園內采集樟屬香樟樹種的樟樹老葉(Cinnamomum camphora(L.)Presl.)，風干(測得干物質含量為47%，w/w)后粉碎，過 32目篩;鄰二氮菲、過氧化氫(30%)、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸亞鐵、鹽酸、鄰苯三酚、鐵氰化鉀、三氯乙酸、檸檬酸、檸檬酸鈉、亞硝酸鈉、鹽酸萘乙二胺、BHT、維生素C、硫代硫酸鈉 試劑均為分析純，購自國藥集團(上海)。

722型可見光分光光度計 上海精密科學儀器有限公司;VCX500超聲波細胞粉碎儀 SONICE＆MATERIALS，INC.USA。

1.2 實驗方法

1.2.1 樟樹葉多酚試樣的制備 試樣a，樟樹葉經過超聲波耦合雙水相法提取得到的樣品。提取方法:樟樹葉→雙水相耦合超聲波萃取→樟樹葉多酚提取物→減壓濃縮→濃縮物→石油醚脫脂→水溶液即為游離多酚粗提取液。其中雙水相體系是40%的乙醇－硫酸銨2g/10mL，超聲波功率是255W，料液比是 1∶38，浸提時間是95min，浸提溫度是 21℃［6］。

試樣b，上述試樣a提取后，所得濾渣加入5倍(v/w)4mol/L NaOH溶液，于室溫下避光水解4h，冰浴中用6mol/L HCl調整溶液的pH至2，用濾渣5倍(v/w)的乙酸乙酯－無水乙醚混合液(1∶1)萃取3次，合并萃取液，于30℃下真空濃縮至干，用去離子水定容得結合多酚粗提取液［7］。

試樣c，試樣a、b合并后，用 AB－8大孔樹脂純化樣品:準確稱取經過預處理的 AB－8大孔樹脂1.00g，置于150mL錐形瓶中，加入樟樹葉多酚提取液50mL(多酚含量1.00g·L－1)，吸附溫度 25℃，多酚溶液 pH5.68，振蕩吸附 4h(100r·min－1)達到平衡后，過濾后，樹脂中加入100mL洗脫溶劑60%的乙醇溶液(v/v)，震蕩解析 2h(100r·min－1)，過濾后濾液于30℃下真空濃縮至干，用去離子水定容，多酚純度為63.56%［8］。

1.2.2 多酚含量測定 以沒食子酸為標準品，采用福林比色法測定樟樹葉多酚含量［9］，標準曲線的回歸方程是 y=0.0931x－0.0054，R2=0.9984。

1.2.3 樟樹葉多酚還原力及清除自由基活性 還原力:還原 Fe3+法［10］。清除羥自由基活性:測定對Fenton反應(鄰二氮菲－FeSO4－H2O2反應體系)產生的羥自由基的清除率［11］。清除 DPPH自由基活性［12］:517nm。清除超氧陰離子自由基活性［13］:鄰苯三酚自氧化法。

1.2.4 樟樹多酚抗油脂氧化 用電子天平準確稱取50g油脂，加入試樣，加熱攪拌到油樣為均勻透明油狀物;不添加任何試劑的油樣置于室溫下，為空白組;不添加任何試劑的油樣置于(65±1)℃烘箱中，為模型組;添加樟樹多酚(多酚添加量0.04%，w/w)的油樣置于(65±1)℃烘箱中，為試樣組;所有樣品每12h測一次POV。

過氧化值 POV(mmol/kg)的測定［14］:硫代硫酸鈉滴定法。

2 結果與分析

2.1 樟樹多酚抗氧化能力

2.1.1 樟多酚還原力 檢測不同濃度的各類物質還原能力結果如圖1所示。一般來說，物質的還原能力與其抗氧化活性成正比。因此，各類物質反應后的生成物在716nm處的吸光度的大小，可以表現出其抗氧化活性的大小，吸光度越大，就表明物質的還原能力越大。

由圖1可知，試樣c的還原能力隨著濃度的增加而增大。而試樣a和b隨著濃度的增加，還原能力的增大表現不明顯。還原能力順序為VC＞試樣c＞試樣b＞試樣a。

圖1 樟樹葉多酚還原能力Fig.1 Antioxidative ability of camphotree leaves polyphenol

2.1.2 樟多酚清除羥自由基活性 不同濃度的各類物質清除羥自由基的能力，如圖2所示。由圖2可以看出:VC的清除率最高，在4mg/mL以前VE清除羥自由基的能力要大于試樣a、b、c，在4mg/mL以后試樣b和試樣c以及VE的清除能力相當于試樣a、b、c，在4mg/mL以后試樣b和試樣c以及VE的清除能力相當，而試樣a清除羥自由基的能力最弱。

圖2 樟樹葉多酚清除羥自由基的能力Fig.2 Scavenging activities of camphotree leaves polyphenol on·OH

2.1.3 樟多酚清除DPPH自由基活性 不同濃度的各類物質清除DPPH自由基的能力實驗如圖3所示。

圖3 樟樹葉多酚清除DPPH自由基Fig.3 Scavenging activities of camphotree leaves polyphenol on DPPH

VC在0.2mg/mL低濃度的時候清除率就達85%以上，試樣b和c清除DPPH自由基的能力相當，且清除率高于同濃度的VE。葉輝等［15］報道樟科木姜子屬毛豹皮樟(老鷹茶)提取物的抗氧化活性強度為:其DPPH自由基清除率在80.56%～88.19%(1mg/mL酚)，本文結果與這一報道基本一致。

2.1.4 樟多酚清除超氧陰離子自由基活性 不同濃度的各類物質清除超氧陰離子自由基活性實驗如圖4所示。

圖4 樟樹葉多酚清除超氧陰離子活性Fig.4 Scavenging activities of camphotree leaves polyphenol on ·

由圖4可以看出，VC的清除效果最好，試樣a的清除效果最差。但試樣b、c的清除效果與VE相當。

2.2 樟樹多酚抗油脂氧化活性

油脂被氧化的程度可以用它的過氧化值(POV)表示，所以POV也是評價物質抗氧化性能的重要指標。測得油脂的POV越大，說明所含有的過氧化物越多。如果在油脂中添加了抗氧化劑，其POV應比未添加的空白樣品有所下降，POV越小，表明物質的抗氧化性能越強不同濃度的試樣抗油脂氧化能力的實驗如圖5所示。由圖5可以看出，隨著時間的增加，油脂的POV一直增加，空白組與模型組POV變化相似，但是樟樹多酚試樣組的POV增長速度比較慢。

圖5 樟樹葉多酚抗油脂氧化能力Fig.5 Effect of camphotree leaves polyphenol on lipid oxidation

當實驗時間達到48h的時候，空白組和模型組的POV分別是15.91、16.17mmol/kg，而樟樹多酚試樣c組在實驗時間72h時，POV為14.94mmol/kg，說明添加了樟樹多酚的油脂被氧化的速度比未添加的慢。試樣c把脂肪氧化的誘導期從48h推遲到84h左右。

3 討論

樟樹多酚的抗氧化特性因為樟樹多酚的分子中含酚羥基，可以提供活潑的氫質子，能夠有效地清除氧自由基，可以預防脂質過氧化的啟動，其次，和過氧化自由基結合生成穩定的化合物，進一步阻止了氧化過程中鏈鎖反應的傳播。除此之外，樟樹多酚和金屬離子生成的絡合物，清除羥基自由基和脂質自由基的能力，以及與自由基形成的半醌自由基的穩定性對樟樹多酚的抗氧化活性的影響也很大。

試樣a、b分別是游離態粗多酚、結合態粗多酚，試樣c為大孔樹脂純化多酚，純度高，它們抗氧化及清除自由基活性的差異可能是因為它們的酚類物質組成不同。酚類是一大類物質。有研究鑒定了樟科木姜子屬毛豹皮樟的抗氧化成分，包括香豆酚、山奈酚、槲皮素等，但從其提取方法看，鑒定的主要是游離態酚［16］。同一材料中，結合態和游離態的酚種類往往有很大差異，如稻殼中游離態酚類物質以丁香酸和香豆酸為主，結合態酚類物質以香豆酸為主［17］。但樟樹葉中兩種酚的組成尚需進一步研究。

此外，還應該考慮到多酚單體物質之間的相互作用。Kanner等［18］對葡萄酒中的酚進行研究的時候發現酚類在作為抗氧化劑時，相互協同的機制起了很大的作用，活性較低的酚能夠使易于被氧化的酚再生。樟樹多酚提取物也有可能存在類似的作用機制。但對樟樹多酚中不同的酚類物質之間協同作用或拮抗作用的機理還需要進一步研究。

4 結論

4.1 三種不同提取純化的樟樹多酚試樣均有一定的抗氧化能力，其對羥自由基、DPPH自由基、超氧陰離子自由基等都有一定的清除作用，特別是對DPPH自由基清除活性最強。多酚的純度對其抗氧化活性有一定影響，經過大孔樹脂純化的試樣c的清除效果最好。

4.2 在實驗濃度范圍內，各試樣的抗氧化活性及清除自由基活性隨著濃度的增加而增大，即存在量效關系。

4.3 抗油脂氧化能力的實驗表明，樟樹多酚可有效延長油脂氧化誘導期，從而阻止油脂氧化。開發樟多酚食品抗氧化劑具有進一步研究價值。

［1］王懷青.樟樹葉精油成分的初步研究［J］.江蘇林業科技，2006，33(1):8－11.

［2］李振華，溫強，戴小英，等.樟樹資源利用現狀與展望［J］.江西林業科技，2007(6):31－33，36.

［3］張國防，陳存及.福建樟樹葉油的化學成分及其含量分析［J］.植物資源與環境學報，2006，15(4):69－70.

［4］蘇遠波，李清彪，姚傳義，等.芳樟樹葉乙醇提取物的抗癌作用［J］.化工進展，2006，25(2):200－204.

［5］劉焱，婁愛華，丁玉珍，等.茶多酚對淡水魚糜脂類及蛋白質的影響［J］.食品工業科技，2009，30(7):291－293.

［6］冉曉敏，李忠海，付湘晉.樟樹多酚提取工藝的研究［J］.食品與機械，2011，27(2):51－54.

［7］朱春秋，程代，蔡曉菲，等.棗果皮結合酚的大鼠體內吸收及抗氧化能力研究［J］.食品工業科技，2012，33(3):352－354.

［8］付湘晉，冉曉敏，張慧，等.大孔樹脂AB－8對樟樹葉多酚的靜態吸附與解析特性研究［J］.福建農林大學學報:自然科學版，2013，42(2):1－4.

［9］郭娟，艾志錄，崔建濤，等.蘋果渣中多酚物質的福林法測定［J］.食品工業科技，2006，27(2):178－180.

［10］薛照輝，吳謀成，羅祖友，等.菜籽肽清除自由基作用的研究［J］.食品工業科技，2005，26(10):71－75.

［11］RAmarowicz.Free－radicalscavenging capacity and antioxidant activity of selected plant species from the Canadian Prairies［J］.Food Chemistry，2004，84:551－562.

［12］許申鴻，杭瑚.一種篩選自由基清除劑的簡便方法［J］.中草藥，2001，31(2):96－97.

［13］武文潔，呂樹祥，宋詩瑩.芝麻提取物抗氧化性能研究［J］.中國食品添加劑，2004(1):70－72.

［14］Xiangjin Fu，Shiying Xu，Zhang Wang.Kinetics of lipid oxidation and off－odor formation in silver carp mince:the effect of lipoxygenase and hemoglobin［J］.Food Research International，2009，42:85－90.

［15］葉輝，郁建平，王建光.老鷹茶提取物抗氧化作用的研究［J］.時珍國醫國藥，2004，15(4):198－200.

［16］陳玉璞，程文明，李俊.老鷹茶中黃酮類化學成分分析［J］.安徽醫科大學學報，2008，43(1):65－67.

［17］李青，張名位，張瑞芬，等.5種秈稻品種谷殼中游離態和結合態酚類物質含量及其抗氧化活性比較［J］.中國農業科學，2012，45(6):1150－1158.

［18］Kanner J，Frankel E，Granit R，et al.Natural antioxidants in grapes and wines［J］.J Agric Food Chem，1994，42(1):64－72.