脊髓性肌萎縮癥SMN1 和SMN2 基因拷貝數變異分析

王 佶 安 宇 周水珍 王 藝 劉仁超

脊髓性肌萎縮癥( SMA) 是常染色體隱性遺傳性神經肌肉病，人群中發病率為1/6 000 ～1/10 000 活產嬰兒，最近報道中國人群SMA 致病基因的攜帶者頻率為1/42［1］。SMA 居致死性常染色體隱性遺傳病第2 位，僅次于囊性纖維變性［2～4］。位于染色體5q11.2 ～q13.3 上的運動神經元存活( SMN) 基因是SMA 的主要致病基因，具有兩個高度同源的拷貝SMN1 和SMN2，兩者僅有5 個堿基的差別，分別位于第7、8 外顯子和第6、7 內含子中。既往研究已證實SMN1 基因突變可導致SMA 發病，SMN2 基因是臨床表型的調節基因，拷貝數增加可減輕SMA 的表型［2，5］。近年來中國對SMN2 基因的研究較少［6，7］，缺乏表型與基因型的分析研究，同時SMA 基因診斷國內多采用PCR-RFLP 分析技術，可判斷SMN 基因純合缺失，但不能分析雜合缺失。本研究納入臨床診斷的SMA 患兒，以多重連接探針擴增( MLPA) 技術行SMN1 基因缺失和SMN2 基因拷貝數檢測，分析其與臨床表型關系，以豐富中國人群SMA 研究數據。

1 方法

1.1 SMA 診斷標準與分型 神經?？漆t生根據發病年齡、臨床表現及病情進展程度進行臨床診斷［8］，檢測到SMN1 基因缺失可確診。根據1992 年國際SMA 協作組制定的兒童型SMA 的臨床分類標準，分為3 個亞型［8］:Ⅰ型:6 月齡內發病，全身肌肉無力，肌張力減退，不能坐和站立，通常在2 歲內死于呼吸衰竭； Ⅱ型:6 月齡后發病，能坐但不能獨自行走，多數在進入青春期前死于呼吸系統并發癥；Ⅲ型:18 月齡后發病，能坐和行走，預期壽命不減少，起病初可表現為走路不穩和易跌倒等癥狀。

1.2 研究對象 復旦大學附屬兒科醫院( 我院) 臨床診斷為SMA 的患兒，納入SMN1 基因第7 和8 外顯子檢測到突變的確診病例，同時檢測患兒父母的SMN1 基因，分析雜合突變情況。本研究SMA 相關致病基因的檢測均獲得患兒家屬的口頭知情同意。

1.3 MLPA 拷貝數分析 采集患兒外周靜脈抗凝血3 mL，采用QIAgen 公司試劑盒( QIAamp DNA blood MiNi Kit 1250，Cat No.51106) 抽取DNA 溶液2 ～5 μg，-20℃保存。

參照SMA MLPA 檢測試劑盒( SALSA MLPA P060-B2 SMA probemix，MRC，荷蘭) 的操作說明進行DNA 變性、探針雜交、連接和熒光引物PCR 擴增，應用ABI 公司的3130自動化序列分析儀進行擴增片段分離、峰高和峰面積的檢測。檢測數據應用GENEMAKER 1.95 軟件分析處理。根據試劑盒的說明推算SMN1 和SMN2 基因第7 和8 外顯子的拷貝數: SMN1 或SMN2 的信號與內參信號的比值為0.7 ～1.3，拷貝數為2，表示為正常；比值為0.35 ～0.65，拷貝數為1，為雜合缺失； 比值為0 表示沒有拷貝，為純合缺失；比值為1.3 ～1.5，拷貝數為3；比值為1.5 ～2，拷貝數為4。以拷貝數2 為參照，多于2 個拷貝數即為重復。

1.4 統計學方法 計量資料以表示，計數資料以百分比表示，率的顯著性采用χ2檢驗，P ＜0.05 為差異有統計學意義。采用SPSS 16.0 軟件進行統計分析。

2 結果

2.1 SMN1 基因拷貝數與臨床表型關系 41 例臨床診斷SMA 患兒進行了基因檢測，37/41 例( 90.2%) SMN1 基因第7 和( 或) 第8 外顯子純合缺失進入分析，其中36 例(97.3%) 為第7 和8 外顯子均純合缺失( 圖1A) ，1 例僅第7 外顯子純合缺失。男20 例，女17 例。平均發病年齡(7.5 ±7.0) 個月，3 d 至6 月齡19 例，～18 月齡14 例，～3歲2 例，＞3 歲2 例。Ⅰ型20 例( 54.1%) ，Ⅱ型15 例(40.5%) ，Ⅲ型2 例( 5.4%) ，Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型平均發病年齡分別為(2.9 ±1.8) 、(10.7 ±1.9) 和(30.0 ±8.5) 個月。

2.2 SMN2 基因拷貝數與臨床表型關系 37 例SMN1 基因第7 和( 或)8 外顯子純合缺失患兒中，SMN2 基因第7 和8 外顯子拷貝數2 為18 例(48.6%) ，平均發病年齡(4.9 ±3.9) 個月，Ⅰ型13 例( 72.2%) ，Ⅱ型5 例( 27.8%) ； 第7和8 外顯子重復( 拷貝數3 或4) 為17 例( 45.9%) ( 圖1B) ，第7 外顯子重復為2 例( 5.4%) ，平均發病年齡( 9.9 ± 8.5) 個 月，Ⅰ型7 例( 36.8%) ，Ⅱ型10 例(52.6%) ，Ⅲ型2 例( 10.5%) ，Ⅱ和Ⅲ型的比例顯著高于拷貝數2 的病例( P ＜0.05) 。

圖1 SMA 患兒SMN1 和SMN2 基因MLPA 檢測結果Fig 1 The results of SMN1 and SMN2 gene detection with MLPA method in SMA children

2.3 SMN1 基因雜合缺失與表型 5 例患兒父母行SMN1基因檢測，檢出雜合缺失9 例，其中4 例患兒父母均為SMN1 基因第7 和8 外顯子雜合缺失( 圖1C) ；1 例患兒父親為SMN1 基因第7 和8 外顯子雜合缺失，母親未檢測到純合或雜合缺失。5 例患兒父母均未見肌肉無力及萎縮等臨床表現。另有1 例檢出SMN1 基因第7 和第8 號外顯子雜合缺失，其臨床特征、肌電圖及肌肉活檢均符合SMAⅠ型的診斷，尚待SMN1 基因測序明確是否存在SMN 基因點突變。

3 討論

SMA 的輔助檢查主要有肌電圖、肌酶和肌肉活檢。肌電圖是定位診斷，但特異度不高。肌酶在鑒別其他肌無力疾病中有參考意義，但對SMA 診斷無特異性。肌肉活檢由于取材的創傷性，患兒不易接受，因此SMA 的基因檢測受到臨床的青睞。既往采用的PCR-RFLP 法由Lefebvre 等［9］建立，除不能分析雜合突變外，實驗要求高、操作繁瑣和穩定性差等限制了其在臨床的廣泛應用。國內也有采用熒光定量PCR 技術檢測SMN 基因拷貝數的報道，該方法檢測靈敏，但因優化為穩定和高效的實驗體系較困難，且不同實驗室采用不同的內參照無法互相比較，對于重復大于3 以上的拷貝數難以準確計數，其用于臨床檢測的實用性不如MLPA。MLPA 是一種高通量、針對待測核酸中靶序列進行定性和半定量分析的技術［10］，可對待測基因所有外顯子進行缺失、重復及某些點突變檢測［11］，國外已有采用該技術分析SMN 基因純合缺失、雜合缺失和拷貝數的報道［12，13］。我院自2011 年10 月起在臨床應用MLPA 技術用于SMA的診斷。

研究表明80% ～90%的SMA 為SMN1 基因純合缺失，5% ～10%的SMA 是由于SMN1 基因發生復合雜合突變所致，即一個SMN1 等位基因缺失，另一個SMN1 等位基因發生點突變［14，15］。歐美人群中SMN1 基因純合缺失檢測已成為診斷和排除診斷SMA 的首選方法［16］。本文41 例臨床診斷SMA 患兒SMN1 基因第7 和( 或) 8 外顯子純合缺失檢出率為90.2%，提示可作為SMA 患兒的首選確診方法，特別是松軟嬰兒( floppy infant) 在嬰兒期臨床表現難以做出臨床診斷時，且肌電圖不能做出定性診斷時，肌肉活檢對于小嬰兒也存有一定困難時，基因檢測的價值更大。本文9/10 名患兒父母檢出雜合缺失，但均無臨床表現，為攜帶者；提示檢測雜合突變一方面可以防止漏診，另一方面也可為產前診斷和咨詢提供依據。

SMN2 基因產生10%全長轉錄產物，是臨床表型的調節基因，基因拷貝數越多，產生全長轉錄產物也增多［5］，可部分補償SMN 蛋白的不足，減輕SMA 表型嚴重程度［17］，也可預測SMA 急性或慢性病程［18］。Feldkǒtter 等［2］對375例SMA 病例的研究也顯示，SMN2 基因拷貝數與SMA 表型嚴重程度呈負相關。本文采用MLPA 技術對SMN2 基因拷貝數變異檢測，顯示拷貝數為2 個的18 例患兒平均發病年齡較早［(4.9 ±3.9) 個月］，其表型以Ⅰ型為主( 13 例) ；SMN2 基因拷貝數3 或4 患兒的平均發病年齡稍晚［(9.9 ±8.5) 個月］，表型以Ⅱ型為主( 10/17 例) ，提示基因拷貝數檢測可作為臨床判斷SMA 預后的方法之一。

本文的局限性:SMA Ⅲ型患兒例數較少，且未進一步細化分析臨床表型和基因拷貝數的相關性，待今后研究進一步完善。

致謝:感謝參加本研究的患兒及家屬；感謝復旦大學附屬兒科醫院神經科醫生和兒科研究所技術人員的支持。

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