從黃酒的釀造工藝上探討氨基甲酸乙酯

孫雙鴿，白衛東，2*，錢 敏，沈 棚

（1.仲愷農業工程學院 輕工食品學院，廣東 廣州 510225；2.華南農業大學 食品學院，廣東 廣州 510642）

氨基甲酸乙酯（ethyl carbmate，EC）又名尿烷（urethane），廣泛存在于發酵食品[1]（如醬油、腐乳等，飲料酒如黃酒、清酒、葡萄酒、蘋果酒等和蒸餾酒[2]如白蘭地、威士忌等）中，早在1943年就被提出其具有潛在致癌作用[3]，后續有眾多相關的研究報道。日本酒行業表態參照加拿大的衛生與福利組織規定的各類酒中的EC限量，并把清酒和我國的黃酒列入加強酒行列中，意味著中國黃酒中EC含量應低于100μg/L。然而EC在通常條件下穩定性很好，尤其在酒體中一經形成就極為穩定，很難分解，中國黃酒中EC含量部分超標的問題并沒有得到很好的解決。

為了弄清黃酒中氨基甲酸乙酯的來龍去脈，從黃酒的釀造工藝上探討黃酒中生成氨基甲酸乙酯的影響因素，同時，針對這些影響因素，對現今國內外控制氨基甲酸乙酯含量的方法也作了介紹。

1 黃酒中氨基甲酸乙酯的形成機制

最早在葡萄酒中研究發現，焦碳酸二乙酯和氨可以反應形成氨基甲酸乙酯[4]，但因焦碳酸二乙酯是一種添加劑，并非酒中EC形成的主要途徑，雖然氰化物與乙醇的反應形成氨基甲酸乙酯[5]是葡萄酒中的主要途徑，但因黃酒與葡萄酒釀造原料及釀造工藝的不同，葡萄酒中的氰化物在糯米中并不存在，也不是黃酒中EC形成的主要途徑。黃酒中氨基甲酸乙酯形成的主要途徑有如下幾方面。

1.1 由氨基甲酰磷酸和乙醇反應形成氨基甲酸乙酯

有關研究發現，已發酵和未蒸餾的酒精飲料中EC的形成絕大部分是由氨甲?；衔锱c乙醇自發反應生成[6]，其反應式：

H2NCO2PO3H2+C2H5OH→H2NCO2C2H5+H3PO4

氨甲酰磷酸、尿素、瓜氨酸、氨甲酸、天冬氨酸、尿素等都屬于氨甲?；衔?，這些物質的醇解都會產生EC，經過實驗得出EC的生成量與乙醇的濃度成正比[7]。但沈棚等[8-9]的研究發現，黃酒中EC的生成量與乙醇的濃度無正比關系。

1.2 由尿素和乙醇反應形成氨基甲酸乙酯

研究發現，黃酒和葡萄酒中絕大部分的EC是由尿素和乙醇反應生成的，其反應式：

H2NCONH2+C2H5OH→H2NCO2C2H5+NH3

尿素一直作為酵母的氮源添加到發酵液中，尤其是釀造高質量的白蘭地原酒時，為了降低影響風味質量的雜醇油的生成，需添加一定量的尿素或硫酸銨等無機氮源。1976年OUGH在實驗中證明了乙醇和尿素在室溫條件下反應72h后產生EC[10]，人們才開始注意到葡萄酒中存在的尿素，之后一些國家已不再準許在葡萄酒生產中使用尿素。

1.3 由瓜氨酸和乙醇反應形成氨基甲酸乙酯

瓜氨酸是尿素循環與精氨酸代謝途徑的中間產物，目前普遍認為瓜氨酸是氨基甲酸乙酯形成的前驅物，方若思等[9]也得出了影響黃酒發酵中EC形成的關鍵前體物是瓜氨酸而非尿素的結論。但也有研究結果表明，葡萄汁中氨基甲酸乙酯形成的數量并不和瓜氨酸含量呈線性關系，需進一步研究[11]。

2 黃酒釀造中氨基甲酸乙酯的形成

釀造黃酒的工藝流程：

原料→浸米→蒸飯→攤涼→拌曲→前發酵→勾兌→后發酵→壓榨澄清→煎酒→裝壇→陳釀

在黃酒的釀造過程中，尿素、瓜氨酸、精氨酸和鳥氨酸是尿素循環和精氨酸脫亞氨基酶（arginine deiminase，ADI）代謝途徑的中間產物，是形成EC的前體物質。沈棚等[8]對客家娘酒中的EC回歸分析發現，EC與尿素、瓜氨酸、精氨酸和鳥氨酸有顯著的相關性，且精氨酸、尿素與EC呈負相關性，鳥氨酸與EC呈正相關性，而乙醇與EC并沒有顯著的相關性。釀造工藝條件對黃酒中EC和EC前體物的影響可以從以下幾個方面探討。

2.1 原料的影響

中國黃酒和日本清酒的原料為秈米、粳米、糯米等。釀造原料中尿素的水平與原料預處理緊密相關，但釀酒用米一般都是精制米，外來尿素不易帶入。研究[12]表明，精制米中的尿素含量遠低于原料米，隨著精制水平的提高，尿素的含量逐漸降低。其中精制程度達到70%～75%的米中尿素的含量是原料米的一半。當使用流動水清洗大米2遍后，尿素的含量也會降低50%。因此提高原料米的精制程度以及加大清洗力度都可以減少尿素含量。但同時，隨著原料預處理力度的加大，許多營養物質也會被清洗液一起帶走[13]，造成營養物質損失。因此原料預處理必須以工藝為基礎進行適當調整。

在各種釀造酒中，黃酒的尿素含量通常較高，常見市售黃酒中的尿素含量為15mg/L～35mg/L[14]。較高的尿素含量就有生成較高EC的可能，這就非常有必要降低黃酒中的尿素含量，從源頭上對EC進行控制。

2.2 曲種的影響

黃酒釀造過程中的微生物主要有霉菌、酵母，乳酸菌及一些有害雜菌，其中霉菌包括曲霉、根霉、紅曲霉等。霉菌或者酵母都屬于真菌，其尿素循環途徑和乳酸菌的ADI途徑的中間產物，是合成EC的前體物質。

發酵酒中90%的EC是由尿素與乙醇反應生成的[6]，尿素的濃度顯著影響發酵酒中EC含量的高低。因此為了降低EC的形成，從根本上來講就是要減少尿素的含量。而減少尿素含量在尿素循環方面有4個途徑[15]：一是原料中蛋白質；二是氨基甲酰磷酸合成酶Ⅰ，乙酰谷氨酸（acetyl glutamic acid，AGA）是此酶的變構激活劑；三是尿素循環時，控制其中間產物的代謝，尿素循環的中間產物（如鳥氨酸、瓜氨酸、精氨酸）的濃度均可影響尿素的合成速度；四是限速酶，精氨酸代琥珀酸合成酶在鳥氨酸循環各酶系中的活性最低，是尿素合成酶的限速酶。ADI途徑方面，從合成途徑的控制酶考慮，精氨酸脫亞胺酶，鳥氨酸氨甲?；D移酶，氨基甲酸激酶等。

黃酒中的尿素主要是酵母菌在代謝過程中分解精氨酸而產生的[16]。發酵過程中，當底物中含有過量精氨酸時，精氨酸可在酵母菌內代謝產生過量的尿素，一部分尿素被利用，另一部分尿素不會立即進行降解，當含量積累到一定程度后，酵母菌將其從胞內釋放到發酵液中，由此導致葡萄酒中尿素含量升高。日本學者[17]利用基因敲除原理構建了精氨酸酶基因缺失的清酒酵母，尿素不積累，但細胞生長速度受到明顯抑制。

陳勝[18]從酒曲等樣品中分離得到了發酵性能穩定且低產尿素、遺傳穩定的酵母，并對其進行紫外線與γ射線聯合誘變，得突變株遺傳性狀穩定的酵母，將突變菌株用于實驗室釀造酵母，比分離所得菌尿素降低51.94%，提高了黃酒釀造的安全性。

而從低產尿素酵母的代謝途徑入手，構建低產尿素酵母有以下的研究。趙然然[19]通過切斷由精氨酸酶基因（CAR1）基因編碼的精氨酸酶，弱化精氨酸分解生成尿素，從而降低發酵醪液中的尿素含量，進而降低酒液中EC含量。朱旭亞[20]強化了由DUR1，2基因編碼的尿素降解途徑，采用工程菌85DUR1，2進行實驗室規模的黃酒釀造，尿素與EC含量分別比出發菌株降低了69.88%和41.26%，室溫貯存150d，工程菌所釀酒中EC含量上升不明顯，而在發酵性能、所釀酒的酒精度、總酸及氨基酸態氮含量等指標方面，工程菌與出發菌無顯著差異。進行連續傳代發酵試驗表明工程菌85DUR1，2的低產尿素性狀具有較好的遺傳穩定性。由于新工藝黃酒生產工藝是采用純種發酵，選育產尿素能力差的黃酒酵母菌進行發酵，能從根本上抑制尿素的形成。多數乳酸桿菌、乳酸球菌都具有分解精氨酸、分泌瓜氨酸的能力，因此對整個發酵過程的雜菌污染的控制對純種發酵的新工藝黃酒中EC的控制有一定作用。

從精氨酸代謝酶的調控作用，有研究表明，L-鳥氨酸鹽酸鹽對黃酒發酵中產生的致癌物EC有一定程度的抑制作用，其作用機制可能是激發胞內鳥氨酸氨甲?；D移酶（ornithine transcarbamoylase，OTC）活力表達，從而導致EC的前體物分解速度加快[21]。

趙雅敏[22]從EC降解菌入手，對具有EC降解能力的菌株進行了篩選，對發酵產酶條件進行優化后，活力提高了3.5倍，固定化細胞處理后EC去除率大大提高。

2.3 發酵工藝條件的影響

黃酒獨特的生產工藝[24]如麥曲釀造、高溫煎酒、長時儲存、年份酒勾兌等都對EC的生成有直接影響。

黃酒發酵分為前發酵、主發酵和后發酵3個階段。前發酵階段主要是酵母增殖期，發酵作用弱，溫度上升緩慢。當醅中的溶解氧基本被消耗完，酵母細胞濃度相當高時，則進入主發酵期，此階段酒精發酵旺盛，酒醅溫度和酒精濃度上升較快，而酒醅中的糖分逐漸減少。經主發酵，醪液中代謝產物積累較多，酵母的活性變弱，即開始進入緩慢的后發酵階段，繼續分解殘余的淀粉和糖分，發酵作用微弱，溫度逐漸降低。

根據王賓等[23]對傳統黃酒發酵過程中精氨酸、瓜氨酸、鳥氨酸濃度變化規律的研究可知，乳酸發酵過程中，精氨酸含量先升高，之后開始下降，在后期階段，菌落開始大量分解精氨酸。瓜氨酸的含量則在發酵了一段時間之后開始升高，但是相對增加較少，在酒化階段，瓜氨酸、精氨酸含量都是先升高后降低。鳥氨酸濃度在酒化階段和糖化階段都是穩步升高的。而根據尿素循環，控制精氨酸含量能直接減少尿素的含量，從而降低EC含量。掌握尿素的中間產物EC的前體物質的規律，能為有效的控制EC的含量提供指導。

而在葡萄酒發酵中，溫度越高發酵結束后葡萄酒中的EC含量也越高。適宜的酒精發酵溫度一方面可以加快酵母代謝精氨酸產生尿素的反應，更重要的是發酵溫度越高，尿素和乙醇反應生成EC的速率越快。有研究報道，溫度每上升5℃，EC的生成量可提高一倍[24]。黃酒與葡萄酒雖然發酵工藝有差別，但是EC的生成量受環境影響是一致的，控制黃酒的發酵溫度，能減少EC的生成量。

釀造及貯存工藝等條件也會影響前體物質尿素等氨甲酰類物質的含量，從而對發酵酒中最終EC濃度產生影響。發酵溫度及陳釀過程中的通風量會影響酒液中的尿素含量[22]。然而，生產工藝條件對酒體風味、酒體風格有直接影響，故相對而言，黃酒生產企業對工藝條件的調整也大多持審慎態度。

2.3.1 勾兌的白酒對EC的影響

客家黃酒的釀造中要在拌曲一周左右添加白酒以終止糖化，乙醇是EC生成的前體物之一，此時添加的白酒其酒精度對成品黃酒中EC的含量也有一定的影響。但對此影響，目前還沒有人進行研究。

2.3.2 后酵對EC的影響

后酵主要進行黃酒風味物質的沉積，包括肽和氨基酸含氮物質的生成以及酯類等風味物質的合成[25]，也是氨基甲酸乙酯緩慢生成的階段。但是此階段從工藝上控制也只能盡量降低儲存溫度，最多的研究是添加酶來抑制或者去除氨基甲酸乙酯。

（1）添加酸性脲酶

在后酵的過程中，可以添加酸性脲酶來分解尿素，以對EC的形成進行控制。

脲酶（urease）又稱尿素氨基水解酶，在自然界中普遍存在，其可以催化尿素分解生成氨與碳酸。

因黃酒壓榨后，還有勾兌澄清與煎酒的過程，在勾兌后的成品酒中添加脲酶，經一定時間處理后在煎酒時利用高溫（90℃～92℃）破壞脲酶的殘余活力。該方法不影響黃酒正常的生產工藝。

脲酶的添加量和作用溫度是尿素分解率高低的主要原因，除此之外酒液的pH值、乙醇含量、蘋果酸和氟化物的含量對尿素酶的分解效果都有一定的影響。隨著脲酶添加量的增加以及作用溫度的不斷升高，尿素分解率迅速提高。周建弟等[26]對酸性脲酶在不同的溫度、用量、時間及酒體pH值下分解黃酒中尿素的酶解特性進行了研究，表明在適宜的條件下，添加酸性脲酶可有效除去黃酒中約80%的尿素。

飲料酒通常為酸性，因此酸性脲酶才能起作用。關于酒用酸性脲酶，目前國外研究較多，早在1990年FUJINAWA S[27]等就將酸性脲酶成功應用于葡萄酒中。2001年兒玉成一等[28]證明了采用酸性脲酶降低葡萄酒中EC含量的有效性與可行性。繼葡萄酒中脲酶的研究后，中國黃酒中脲酶的研究陸續展開，近幾年也有所突破，2008年楊魯強[29]對酸性脲酶進行制備、純化，尿素的去除率達到83%；2009年王松華[30]對一株產酸性脲酶細菌進行了生理生化及分子生物學鑒定，所產酸性脲酶在黃酒中24h的尿素去除率也達到65.2%，并且初步認為是大腸桿菌屬細菌中一種未報道的脲酶蛋白；2012年呂園園[31]將殼聚糖-明膠復合固定化酸性脲酶酶膜以卷式膜形式，放入層析柱中制做成酶膜反應器，黃酒中尿素去除率達54.8%，氨基甲酸乙酯含量降低率達55.6%，且未改變黃酒風味和黃酒中的多酚含量。

添加酸性脲酶不需要換酵母菌，不改變生產工藝條件和原酒風味特性，并且使用簡單、見效快。在各釀造酒中，黃酒尿素的含量通常較高，因此，此方法對中國黃酒更為適用。能產生比較穩定的酸性脲酶的微生物是發酵乳桿菌。由于中國黃酒特有的復雜組分，適合其他酒種的酸性脲酶，不一定很適合中國黃酒中的應用。目前，來自乳酸菌的酸性脲酶已實現商業化應用。但我國脲酶的生產還未形成產業化，國內企業使用的脲酶主要依靠進口，脲酶純度低是阻礙我國脲酶產業化的主要原因之一。

（2）添加酸性EC酶

EC酶即是能直接降解EC的酶，此方法降解EC方便快捷。關于EC降解酶，從1989年開始即陸續有報道，但這些EC酶通常不耐酸和醇，耐酸、耐醇的EC酶也因為其對EC的親和力很低，不適于酒精飲料。已知可以作為酒用的EC酶來自葡萄糖酸桿菌、黃桿菌[32]、地衣芽孢桿菌[33]等，陳堅等[34]有報道產酸克雷伯氏菌可以產成黃酒用氨基甲酸乙酯酶。

2.3.3 煎酒條件的影響

把澄清后的生酒加熱煮沸片刻，殺滅其中所有的微生物，破壞酶的活性，改善酒質，提高了黃酒穩定性，便于貯存、保藏，這一操作過程稱滅菌，俗稱煎酒。

黃酒具有獨特的高溫（85℃左右）煎酒工序，煎酒對黃酒的穩定性和香氣形成具有重要作用。煎酒溫度高，能使黃酒的穩定性提高，但酒液中的尿素和乙醇會隨著煎酒溫度的升高和時間的延長而加速形成更多的EC[14]。經煎酒生成的EC，對在終端進行黃酒中EC含量的控制，提出了特殊的需求。因此，在不影響黃酒風味前提下，應適當降低煎酒溫度和減少煎酒時間。日本清酒僅在60℃時滅菌2min～3min，比黃酒低得多。降低煎酒溫度還能減少酒精成分揮發損失，減少糖和氨基化合物反應生成的色素物質，焦糖含量。因此在保證微生物被殺滅的前提下應適當降低煎酒溫度。目前各酒廠的煎酒溫度普遍在85℃～95℃。各生產廠家都憑經驗掌握煎酒時間，沒有統一標準。

2.3.4 陳釀條件的影響[14]

中國黃酒的儲存多在自然條件下，經適當儲存后酒質改善，且對黃酒香氣口感的提高具有較大作用，而貯酒時間的延長也伴隨著EC含量的增加。經儲存后的黃酒中已生成一定量的EC，這部分EC也同樣對在終端進行黃酒中EC的控制，提出了特殊需求。適當降低儲酒溫度，對控制EC的含量是有利的。

2.4 直接減除技術

EC直接去除方面很少有人研究，能直接去除EC也是個好方法，其難點在于專一的去除EC，同時能很好的保持酒的風味。

劉俊等[35]對各種吸附性材料中優選得特異性功能樹脂材料L2、L3，復配后以添加量10%（v/v）處理酒樣，對黃酒中的EC去除率在60%以上，基本達到EC限量要求，同時對酒體風味的保持較好。

3 小結與展望

黃酒中氨基甲酸乙酯的研究目前還在發展階段，EC含量與瓜氨酸、精氨酸、尿素、乙醇的相關性各研究人員各執一詞。借鑒國外控制酒類飲料中EC含量的方法，找出適合中國黃酒的微生物、酶、工藝條件等控制EC含量的途徑仍在研究中，而控制最直接、最簡便、最廉價，并且適用于工業大規模生產的方法目前看來仍是路長漫漫。不過隨著科學技術的發展、在研究人員的不斷努力下，一定可以采取措施將黃酒中EC的含量控制在最低值，并且出臺中國黃酒中EC的限量標準，以保證人民身體健康，將中華民族黃酒文化繼續傳承下去。

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