傳統發酵飲料博扎中酵母菌的分離和鑒定

吾爾恩·阿合別爾迪，楊曉絨，木古麗，焦子偉

（伊犁師范學院 化學與生物學院，新疆 伊寧 835000）

博扎（柯爾克孜語勃左）是一種用小米粉自然發酵而成的發酵飲料，其制作和保藏工藝天然傳統，是一種酒精度低、糖度低、質地濃稠的天然發酵飲料。博扎的起源可追溯到居住于前奧托曼土耳其的古老民族，作為一種健康飲品延續至今，不僅在其原產地仍然盛行，而且廣泛傳播至美洲、亞洲等地區，至今只有在我國新疆部分地區的柯爾克孜族家庭中仍保留著制作和飲用博扎的習慣[1]。

長期飲用博扎可助消化，治療胃病、高血壓、冠心病等。博扎含酒精很低，既有醪糟的長處，又有啤酒的優點。從釀制、用料、加工到酒的形態都和醪糟都很相似[2]。

目前含醇飲料的消費趨勢已經向低醇化、營養化及功能化方向發展，因此應擴大和加強對博扎，尤其是對其微生物成分的研究，可豐富我國益生菌資源庫。有關博扎中微生物成分的報道較少，努爾古麗·熱合曼等[1]報道博扎中有植物乳桿菌（Lactobacterium plantarum）、短乳桿菌（Lac tobacillus brevis）、蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）、巴氏醋酸桿菌（Acetobacerpasteurianus）、啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等微生物成分。因為自然環境和工藝制作的差異、原料的不同，各地區博扎中微生物種類可能也不同。從伊寧市三家博扎店采3個樣品，分離和鑒定其中的酵母菌對博扎的研制提供科學依據。

1 材料與方法[3]

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來源

采自新疆伊寧市塔爾米為原料的市售博扎，采集后置于4℃冰箱保存。

1.1.2 培養基[4-13]

酵母菌富集培養基，馬丁氏培養基，豆芽汁葡萄糖培養基，麥氏培養基，玉米粉瓊脂培養基，葡萄糖（乳糖、蔗糖）發酵培養基，油脂培養基，明膠液化培養基，硝酸鹽還原試驗培養基，石蕊牛奶培養基，同化碳源基礎培養基，同化氮源基礎培養基等。

1.2 儀器與設備

GHP-9050隔水電熱恒溫培養箱：上海艾牧生物科技有限公司；YXQ-LS-T5SII型立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；GRC-200恒溫振蕩培養箱：上海新苗醫療器械制造有限責任公司；HC-3018R高速冷凍離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；FA1004-HANGPING電子天平：上海天平儀器廠；ZHJH-2109C水平流超凈工作臺：上海智城分析儀器制造有限公司；MC-SP21105多功能電磁爐：廣州美的生活電器制造有限公司；揚天T2900D微型計算機：聯想（北京）有限公司；SFC-288生物顯微鏡：麥克奧迪實業集團有限公司。

1.3 方法

1.3.1 分離純化酵母菌

首先通過酵母菌富集培養基，于28℃富集培養24h。然后將富集培養后的菌株接入馬丁氏培養基中，培養48h，將培養后長出的單個菌落分別挑取少許菌苔接種在豆芽汁葡萄糖培養基的斜面上純化，純化2～3次，置于4℃冰箱中保存備用。

1.3.2 酵母菌的鑒定

酵母菌的鑒定程序、方法參考文獻[6，14-15]。

酵母菌的形態觀察：

（1）菌落特征的觀察

肉眼觀察生長在豆芽汁葡萄糖平板上的酵母菌菌落，根據菌落大小，菌落顏色，菌落形態進行描述。

（2）觀察出芽生殖

在載玻片上滴1滴蒸餾水，挑取少量酵母放入蒸餾水中，制成臨時裝片，觀察菌體細胞的大小與出芽方式。

（3）觀察子囊孢子

①將酵母接種于豆芽汁培養基中，于28℃～30℃培養24h，然后連續傳代3～4次，最后轉接到麥氏培養基，在25℃～28℃培養3d左右，使其形成子囊孢子；

②從形成子囊孢子的菌落中，取出少量菌體，在載玻片上制作涂片，干燥、固定后，在涂菌處滴5%孔雀綠染液，10min后用水沖洗，再用0.5%番紅染液復染1min；

③將涂片置于顯微鏡下，觀察子囊孢子的形狀、特點。（4）假菌絲形成

新培養物劃線接種于玉米瓊脂培養基上，25℃～28℃培養3d～5d，制成臨時裝片，置于顯微鏡下觀察。

酵母菌生理生化特征檢測：

（1）糖類發酵實驗

糖類選用葡萄糖、蔗糖、乳糖制備培養基，用1.6%溴甲酚紫溶液將培養基調至紫色，115℃、30min滅菌（滅菌后加10%糖液），接種，置于37℃恒溫箱內培養24h，另一支管不接種作為對照，觀察酵母菌對不同糖類的發酵產酸能力。

（2）油脂水解實驗

配制油脂培養基時，預先加入中性紅指示劑或溴甲酚紫指示劑來完成檢驗，將油脂固體培養基融化后，充分振蕩（使油脂分布均勻）傾入無菌空白培養皿，凝固后制成平板，接種，培養48h，觀察培養基中的脂肪是否被分解。

（3）碳源同化測定

使用生長譜法測定碳源同化。

①制備菌懸液：3mL～5mL無菌生理鹽水倒入斜面，洗下菌苔，4000r/min離心15min，加無菌生理鹽水洗滌，4000r/min離心30min，最后用無菌生理鹽水10mL，制成菌懸液，30℃振蕩培養24h；

②制混菌平板：取1mL菌懸液和融化后冷卻至50℃左右的基礎培養基傾注于無菌培養皿中，制成混菌平板，于30℃培養3h。平板底面預先劃區，標記滴加的糖類名稱；

③加糖液：取出培養3h的混菌平板，用浸泡過葡萄糖、蔗糖、乳糖的小圓濾紙片，分別放在平板上已劃分好的位置上，30℃恒溫培養箱繼續培養24h，觀察酵母菌對不同碳源的利用情況。

（4）氮源同化測定

生長譜法測定氮源同化：①制備菌懸液②制混菌平板③培養基中分別加入0.78%硝酸鉀、0.78%硫酸銨，接種，30℃恒溫培養箱繼續培養24h，觀察酵母菌對不同氮源的利用情況。

制備明膠培養基，用穿刺法接種酵母菌，置于20℃～22℃恒溫箱內培養4d～5d，觀察培養后的明膠培養基的變化。

（5）硝酸鹽還原試驗

將酵母菌接種于硝酸鹽液體培養基中，將3支管置于37℃恒溫箱，培養1d、3d、5d，另外一支管不接種作對照。取干凈的空試管，在試管中倒入少許培養基液，再滴一滴A液及B液，在對照管中同樣加入A、B液各一滴，觀察顏色反應（溶液如變為粉紅色、玫瑰紅色、橙色、棕色等表示有亞硝酸鹽存在，為硝酸鹽還原陽性）。

（6）明膠液化試驗

利用明膠作為凝固劑的培養基，用穿刺法接種酵母菌，置于20℃～22℃恒溫箱內培養4d～5d，觀察培養后的明膠培養基的變化。

（7）牛奶胨化試驗

①配制牛奶石蕊培養基：脫脂牛奶粉100g，石蕊0.075g，蒸餾水1000mL，混合后的顏色呈丁香花紫色為適度，pH6.8，121℃滅菌15min。

②分裝試管，接種，置于37℃恒溫箱內培養7d，另外保留一支不接種的石蕊牛奶培養基作為對照。

2 結果與分析

2.1 酵母菌的個體形態學特征觀察結果

將自然發酵飲料博扎的10-4、10-5和10-63個濃度的稀釋液經富集培養后，在馬丁氏培養基中培養48h，再在豆芽汁葡萄糖培養基中培養48h，純化2次，觀察菌落特征，借助顯微鏡來觀察酵母菌的出芽生殖及假菌絲，再對其進行接代培養，結合顯微鏡觀察子囊孢子，結果見表1。

表1 菌落形態和細胞形態結果Table 1 Results of colony shape and cellular morphology

酵母菌的個體形態大小、出芽方式、能否產生假菌絲以及子囊孢子形成能力，是酵母菌鑒定的重要依據。結果顯示，酵母菌大多呈圓形、卵圓形、橢圓形，長約5.4μm，Y4、Y6、Y9、Y10均產生了菌絲，Y3、Y5、Y11均能產生卵圓形子囊孢子，Y1、Y2、Y4、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y12未能觀察到子囊孢子的形成。

2.2 酵母菌的生理生化特征測定結果

2.2.1 酵母菌的糖發酵結果

分別選取葡萄糖、蔗糖、乳糖進行糖發酵實驗，結果見表2。

表2 酵母菌的糖發酵結果Table 2 Results of yeast sugar fermentation test

從表2可以看出，菌株Y3、Y5、Y11發酵能力較好，Y1、Y2、Y4、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y11、Y12僅對葡萄糖有發酵能力。

2.2.2 油脂水解的測定結果

在配制油脂培養時，預先加入中性紅指示劑來完成產生脂肪酸的檢驗。經接種培養24h后，觀察平板底層長菌處。結果有平板底層長菌處有紅色斑點出現，則表示酵母菌產生了脂肪酶，將培養基中的脂肪分解為甘油及脂肪酸，此為正反應。說明所有酵母菌菌株具有分解脂肪的能力。

2.2.3 同化能力的測定結果

各株酵母菌對不同碳源、氮源的利用能力差異明顯，結果見表3。

由表3可以看出，12株酵母菌對不同碳源、氮源的利用能力有差異，菌株Y1、Y2、Y4、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y12碳源同化葡萄糖、蔗糖，不同化乳糖，Y5、Y11碳源同化能力較弱，同化葡萄糖，不同化蔗糖、乳糖。菌株Y3、Y5、Y4、Y6、Y9、Y10、Y11氮源同化硫酸銨，不同化硝酸鉀，Y1、Y2、Y7、Y8、Y12氮源同化能力較強。

表3 酵母菌的碳源、氮源同化結果Table 3 Assimilation results of yeast carbon and nitrogen source test

2.2.4 硝酸鹽還原試驗測定結果

硝酸鹽還原是指能把培養基中的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，培養基中加入格里斯試劑時，溶液呈現粉紅色、棕色、橙色、玫瑰色等。對12株菌株進行硝酸鹽還原測定，菌株Y1、Y2、Y7、Y8、Y12培養基溶液呈現玫瑰紅色，菌株Y3、Y5、Y11培養基溶液呈現橙色，菌株Y4、Y6、Y9、Y10培養基溶液呈現棕色。結果顯示均有亞硝酸鹽存在，為硝酸鹽還原陽性。

2.2.5 明膠液化試驗的測定結果

明膠培養基經酵母菌利用后，均由原來的固態變為液態，說明酵母菌具有分解明膠的能力，能向外分泌蛋白酶，分解明膠而產生小分子物質。

2.2.6 牛奶胨化實驗測定結果

酵母菌對牛奶的利用主要是指對乳糖及酪蛋白的分解和利用。牛乳中加入石蕊作為酸堿指示劑和氧化還原指示劑，石蕊中性時呈淡紫色，酸性時呈紅色，堿性時呈藍色，還原時則部分或全部脫色。對12株菌株進行牛奶胨化培養，均呈現橙紅色，說明酵母菌發酵乳糖后產酸，使石蕊牛乳變紅。酵母菌具有發酵乳糖產酸能力。

3 結論

試驗結果表明，Y1、Y2、Y7、Y8、Y12菌株細胞圓形或卵圓形，為兩段芽殖，無子囊孢子；其發酵葡萄糖，不發酵蔗糖、乳糖；碳源同化葡萄糖、蔗糖，不同化乳糖；氮源同化硝酸鉀和硫酸銨；牛奶反應陽性；明膠液化陽性；硝酸鹽還原陽性。綜合該菌以上特征，根據《The Yeast，A Taxonomic Study》[8]初步鑒定為真菌門半知菌亞門，芽孢菌綱隱球酵母目，隱球酵母科隱球酵母屬（Cryptococcus）。

Y4、Y6、Y9、Y10菌株細胞卵圓形或圓形，兩端芽殖，液具環，無子囊孢子；玉米粉培養基載玻片培養時，可見大量的假菌絲；發酵葡萄糖、蔗糖，不發酵乳糖；碳源同化葡萄糖、蔗糖，不同化乳糖；氮源同化硫酸銨，不同化硝酸鉀；牛奶反應陽性；油脂分解；明膠液化陽性。綜合該菌以上特征，根據D亞羅《酵母菌的特征與鑒定手冊》[6]初步鑒定為真菌門半知菌亞門，芽孢菌綱隱球酵母目，隱球酵母科假絲酵母屬（Candida）。

Y3、Y5、Y11菌株細胞圓形或卵圓形，周邊芽殖，有1～4個子囊孢子；發酵葡萄糖、蔗糖，不發酵乳糖；碳源同化葡萄糖、蔗糖，不同化乳糖；氮源同化硫酸銨，不同化硝酸鉀；牛奶反應陽性；明膠液化陽性；油脂分解。綜合該菌以上特征，根據J.A.尼巴特《酵母菌的特征與鑒定手冊》[9]初步鑒定為真菌門子囊菌亞門，子囊菌綱內孢霉目，內孢霉科釀酒酵母屬（Scerevisiae）。

[1]努爾古麗·熱合曼，華長春，朱曉瑩，等.新疆柯爾克孜族傳統發酵飲料博扎中微生物群落結構的PCR-DGGE分析[J].食品科學，2012，33（1）：111-114.

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