高效液相色譜-串聯質譜聯用法(HPLC-MS/MS)同時測定辣椒制品中的10種工業染料

龍四紅，梁桂娟*，李紅洲，肖 洋，孫 棣

（貴州省產品質量監督檢驗院，貴州 貴陽 550003）

工業染料是用于紡織品、皮革制品及木制品的染色的物質，因價格便宜、著色強、穩定性強，所以也被不法商販用作替代食品染料的著色劑。非法添加到食品中而被廣為熟悉的工業染料包括蘇丹紅、羅丹明B、堿性橙、堿性嫩黃、酸性橙等。工業染料都是具有一定毒性的化學品，很多具有高毒性、高殘留和“三致”等副作用，添加了工業染料的食品會對人體造成嚴重的危害。2008年12月衛生部發布的《食品中可能違法添加的非食用物質和易濫用的食品添加劑品種名單（第一批）》中明確將蘇丹紅、羅丹明B（玫瑰紅B）、堿性嫩黃等工業染料列入非食用物質名單。

在眾多的工業染料中，僅蘇丹紅、羅丹明B等少數幾種物質有國家或行業檢測標準[1-5]，文獻報道的也大多數是采用高效液相色譜法檢測[6-9]。由于辣椒制品中基質較為復雜，用高效液相色譜法容易出現干擾峰，從而給結果的判定造成困擾。高效液相色譜-串聯質譜聯用法具有靈敏度高、專屬性強等的特點[10-15]，本研究旨在針對辣椒制品中容易被非法添加的10種工業染料，建立準確、簡便、快捷的液質聯用檢測方法，為食品質量監管部門提供準確、及時的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

堿性橙Ⅱ標準品（純度≥99%）、堿性嫩黃標準品（純度≥97%）、羅丹明B標準品（純度≥97%）、酸性橙Ⅱ標準品（純度≥98%）、蘇丹紅Ⅰ、蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅲ、蘇丹紅Ⅳ（純度分別≥90.5%、90.0%、96.0%、92.0%）標準品：Dr.Ehrensforfer GmbH Germany公司。

甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、甲酸（色譜純）等試劑：德國Merck公司。

辣椒制品樣品：購于當地農貿市場。

1.2 儀器與設備

TSQ QUANTUM ULTRA高效液相色譜-串聯質譜儀：美國Thermo公司；Mnltireax振蕩混勻器：德國Heidolph公司；Allegra X-22R冷凍離心機：美國貝克曼庫爾特公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準儲備溶液的配制

準確稱取0.1g（精確至0.0001g）堿性橙Ⅱ、堿性橙21、堿性橙22、堿性嫩黃O、羅丹明B、酸性橙Ⅱ、SUDANⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ標準品。堿性橙Ⅱ、堿性橙21、堿性橙22、堿性嫩黃O、羅丹明B、酸性橙Ⅱ用10mL水溶解后用乙腈定容至100mL；蘇丹紅Ⅰ、蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅲ、蘇丹紅Ⅳ用乙腈溶解并定容至100mL，分別配制成1mg/mL的各目標物標準儲備溶液。

1.3.2 樣品前處理

稱取經組織搗碎機搗碎并混合均勻的樣品2g（精確到0.01g），置于50mL聚四氟乙烯離心管中，加入10mL乙腈均質30s后充分振蕩提取20min，8000r/min、低溫（5℃）離心5min，上清液過0.22μm濾膜待測。

1.3.3 空白基質工作使用溶液的配制

稱取2g（精確到0.01g）空白辣椒制品，加入不同體積的標準儲備溶液，按1.3.2的樣品處理方法進行操作，使得空白樣品中10種工業染料的最終濃度為0.1ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL。

1.3.4 儀器條件

液相色譜條件：液相色譜柱Thermo Hypersil GOLD（100mm×2.1mm，粒徑 3μm）；柱溫30℃；流速400μL/min；進樣量10μL；梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫程序Table1 program of gradient elution

質譜條件：正離子模式（electrospray ionization，ESI+）和負離子模式（electrospray ionization，ESI-）同時采集，噴霧電壓3000V，蒸發氣溫度350℃，離子傳輸毛細管溫度270℃，鞘氣壓力4.5MPa，輔助氣壓力0.5MPa，掃描模式：選擇反應監測模式（select reaction monitoring，SRM）。各目標物質定性定量離子對及優化后的質譜參數見表2。

1.3.5 樣品測定

將上述空白基質標準溶液和待測樣液在1.3.4的儀器條件下，用HPLC-MS/MS方法測定。

1.3.6 定性及定量

表2 10種工業染料的質譜條件Table 2 Mass spectrometric conditions of ten kinds of dyes

在表2儀器條件下對基質加標溶液和樣品溶液進行測定，根據目標化合物的保留時間和定性定量離子所對應色譜峰面積的相對豐度進行定性。要求待測化合物的保留時間與標準溶液中化合物的保留時間一致（標準偏差小于20%），同時要求待測試樣中目標化合物的定性定量離子所對應的色譜峰面積之比與標準溶液中目標化合物的定性定量離子所對應的色譜峰面積之比一致，即當相對豐度＞50%、20%～50%、10%～20%、＜10%時，容許偏差分別為20%、25%、30%和50%。以標準溶液濃度對定量離子對的峰面積繪制標準曲線，外標法定量。

2 結果與討論

2.1 樣品前處理方法的確定

為探索簡便、快速、適用范圍廣且回收率高的前處理方法，本研究對提取溶劑、提取時間等進行了探索。對比了不同體積分數的甲醇/水、乙腈/水對樣品的提取效率，發現純乙腈對10種染料的綜合提取率最高且在20min后提取率達到最大。因此選擇乙腈作為10種工業染料的提取溶劑。

2.2 色譜與質譜條件的優化

實驗研究的10種目標物質中，酸性橙Ⅱ采用負離子模式，其余9種采用正離子模式，因此選擇正負離子同時采集模式，掃描模式采用SRM選擇反應監測模式。通過在流動相中加酸后發現，7種正離子模式采集的物質靈敏度均有較大幅度的提高，而對負離子模式采集的酸性橙Ⅱ影響不明顯。對比了0.1%甲酸水-甲醇，0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈后，發現從分離時間、分離效果，靈敏度等方面，0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈都要優于前二者，故采用0.1甲酸水-0.1%甲酸乙腈的流動相體系。各目標物質的質譜圖見圖1。

圖1 10種工業染料物質標準品的質譜圖Fig.1 Mass spectra of ten kinds of industry standard dyes

2.3 10種染料物質的線性方程、線性范圍、相關系數及其檢出限

為消除辣椒制品帶來的基質效應影響，采用空白基質加標的方式制作標準曲線。對空白基質加標工作溶液在1.3.4的儀器條件下進行測定，得到其線性方程及相關系數。按信噪比S/N=3以及本方法的定容體積和取樣量，計算其檢出限。線性方程、線性范圍、相關系數及其檢出限見表3。

表3 線性方程、相關系數、線性范圍與檢出限Table 3 Linear ranges,regression equations,correlation coefficients and limit of detection(LOD)

由表3可知，10種工業染料在各自的線性范圍內呈現良好的線性關系，相關系數R2為0.9963～0.9999，檢出限在1.0μg/kg～5.0μg/kg。

2.4 方法的回收率與精密度

對樣品進行高、中、低3種濃度水平的加標回收率實驗，每一水平重復測定3次，加標回收率、相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）結果見表4。

表4 方法的回收率及重現性(n=3)Table 4 Results of recovery rate,relative standard deviation(RSD)

由表4可知，用該方法對辣椒制品中的10種工業染料進行測定，加標回收率介于71.4%～102.9%之間，相對標準偏差均小于10%，滿足方法學要求。

2.5 樣品的測定

在對40個批次的油辣椒制品檢測中，發現2個批次的樣品中檢出蘇丹紅Ⅰ，含量分別為45μg/kg和70μg/kg，1個批次檢出羅丹明B，含量為63μg/kg。

3 結論

建立了高效液相色譜-串聯質譜法（HPLC-MS/MS）快速檢測食品中10種工業染料的方法。實驗表明，該方法前處理簡單，簡便靈敏，準確快速，10種工業染料在各自的線性范圍內呈現良好的線性關系，相關系數（R2）在0.9963～0.9999，檢出限為1.0μg/kg～5.0μg/kg，加標回收率為71.4%～102.9%，相對標準偏差均小于10%。適用于監管部門對辣椒制品進行日常的監督抽查和大規模的風險監測。

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