靶向B7-H3基因RNA干擾慢病毒的構建及人胰腺癌PaTu8988穩定感染細胞株的建立

趙鑫 張光波 李智 干文娟 朱東明 趙華 張子祥 李德春

·論著·

靶向B7-H3基因RNA干擾慢病毒的構建及人胰腺癌PaTu8988穩定感染細胞株的建立

趙鑫 張光波 李智 干文娟 朱東明 趙華 張子祥 李德春

目的構建靶向人B7同源性3(B7-H3)基因的小發夾RNA(shRNA)的慢病毒載體，并建立穩定感染的胰腺癌PaTu8988細胞株。方法根據GenBank提供的B7-H3 cDNA序列，設計4條靶向B7-H3的siRNA序列，構建重組干擾質粒pGCSIL-GFP-B7-H3-shRNA。將重組干擾質粒和過表達B7-H3質粒共同轉染293T細胞，經蛋白質印跡法篩選出干擾效果最佳的重組干擾質粒。該質粒經慢病毒包裝，并感染胰腺癌PaTu8988細胞株，建立穩定低表達B7-H3細胞株。應用實時定量PCR及蛋白質印跡法檢測細胞B7-H3基因的表達抑制率。結果攜帶干擾效果最好的shRNA的慢病毒感染PaTu8988細胞，建立了穩定低表達B7-H3基因的PaTu8988細胞株，其B7-H3 mRNA表達的抑制率達96.8%，B7-H3蛋白表達的抑制率達88.1%。結論成功構建了人B7-H3-RNAi的慢病毒載體，并建立了穩定感染的低表達B7-H3基因的PaTu8988細胞株。

胰腺腫瘤； B7-H3； RNA干擾； 慢病毒感染

B7同源性3(B7 Homolog 3, B7-H3)分子是T細胞共刺激分子B7-CD28家族的新成員，在多種惡性腫瘤中高表達，被認為有望成為新的腫瘤標志物和潛在的治療靶點。為此，我們設計了靶向B7-H3基因的小分子RNA干擾(siRNA)序列，構建表達人B7-H3-shRNA的慢病毒載體，并建立穩定的人胰腺癌PaTu8988感染細胞株?，F將結果報道如下。

材料與方法

一、B7-H3干擾序列插入載體pGCSIL-GFP

根據B7-H3(NM_001024736)基因序列設計4條靶向B7-H3的siRNA序列(siRNA1、siRNA2、siRNA3、siRNA4)，siRNA1：5′-CAGCTGACAGATACC-AAACAG-3′；siRNA2：5′-CAAAGAAGATGATGGACA-AGA-3′；siRNA3：5′-CTCTGAAACACTCTGACAGCA-3′；siRNA4：5′-GAGCAGGGCTTGTTTGATGTG-3′。據此設計相應互補的單鏈DNA，按5p向3p順序依次為：酶切位點(Age I)、siRNA正向序列、Loop環(CTCGAG)、siRNA反向互補序列、終止信號(TTTTT)、酶切位點(EcoR I)。另設計1條用于陰性對照的無關序列siRNA-C，通過BLAST驗證該序列對于任何基因無干擾效應。所有小發夾RNA(shRNA)由上海吉凱基因化學公司合成。

應用限制性內切酶Age I和EcoR I雙酶切空載體pGCSIL-GFP(上海吉凱基因化學公司)，分別與稀釋和退火后的4種shDNA及shRNA-C進行連接，轉染用氯化鈣制備的新鮮大腸桿菌感受態細胞，涂布加氨芐青霉素的LB固體培養基，37℃培養過夜。以不加載體及加空載體為對照。挑取平板上的菌落，使用載體多克隆位點兩端的引物進行PCR擴增檢測陽性菌落。多克隆位點兩端的引物序列為：5′-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3′；5′-GTAATA-CGGTTATCCACGCG-3′。陽性克隆再經測序驗證。

二、293T細胞轉染

293T細胞(ATCC公司)培養于24孔板，當細胞密度為80%～90%時換成400 μl的Opti-MEM1，分為空白對照組、shRNA-C組、shRNA1組、shRNA2組、shRNA3組、shRNA4組?？瞻讓φ战M為單純293T細胞組，其他各組采用脂質體方法分別將插入相應shRNA的重組干擾質粒及過表達B7-H3的質粒pEGFP-N1-B7-H3-3FLAG-GFP(上海吉凱基因化學公司)共轉染293T細胞，每孔加過表達載體0.5 μg，重組干擾質粒0.4 μg，Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)2 μl。轉染24 h后在熒光顯微鏡下觀測轉染效果，36 h后收集細胞，抽提蛋白，采用蛋白質印跡法檢測轉染細胞Flag蛋白的表達，以GAPDH為內參。蛋白質印跡法試劑盒購自上海生工公司，按說明書操作。鼠抗Flag抗體購自Sigma公司，鼠抗GAPDH抗體、羊抗鼠IgG二抗購自Santa Cruz公司。以此選擇干擾效果最佳的shRNA序列。

三、慢病毒重組體的包裝

取對數生長期的293T細胞，以1.2×107個細胞的密度接種于15 cm的培養皿，常規培養24 h，當細胞融合達70%～80%時，換無血清培養基培養2 h。在滅菌離心管中加入干擾效果最佳的重組干擾質粒20 μg或shRNA-C陰性對照質粒20 μg，輔助質粒pHelper1.0及pHelper2.0載體各10 μg，加Opti-MEM 混勻，調整總體積為2.5 ml，在室溫下溫育5 min。在另一試管中加100 μl Lipofectamine 2000及2.4 ml Opti-MEM混勻。將前述兩管混合，室溫溫育20 min，轉移至293T細胞的培養皿培養8 h，更換含血清培養基繼續培養48 h，收集病毒上清液，于4℃ 4000×g離心10 min，再用直徑為0.45的PVDF濾膜過濾后分裝，用于病毒滴度測定和細胞感染。

四、慢病毒感染PaTu8988細胞

PaTu8988細胞為本實驗室自國外引進并保存，常規培養，以5×104個細胞接種于6孔板內，培養24 h。待細胞融合達30%時分為空白對照組、陰性對照組、干擾組，不加或分別加入1.5×109Tu/ml的相應慢病毒4 μl(MOI:20)及Polybrene感染細胞12 h，棄培養基，加入2 ml含有10% FBS的1640培養基繼續培養4 d，觀察帶熒光的慢病毒感染細胞，流式細胞儀檢測感染效率。再經sorting流式細胞儀分選感染細胞后，檢測細胞GFP陽性表達率。

五、感染細胞株B7-H3 mRNA和蛋白檢測

取上述3組細胞培養72 h，待細胞融合度達90%時收集細胞。按照Trizol法提取細胞總RNA，熒光實時定量PCR法檢測B7-H3的表達。B7-H3引物序列上游5′-CTCTGCCTTCTCACCTCTTTG-3′，下游5′-CCTTGAGGGAGGAACTTTATC-3′，擴增長度134 bp；內參GAPDH引物序列上游5′-TGACTT-CAACAGCGACACCCA-3′，下游5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′，擴增長度121 bp。PCR反應條件：95℃ 15 s，95℃ 5 s、60℃ 30 s，45個循環。每次在延伸階段讀取吸光值，制作熔解曲線。PCR結束后，95℃變性1 min，然后冷卻至55℃，使DNA雙鏈充分結合，從55℃開始每4 s增加0.5℃，直到95℃，同時讀取吸光值。采用2-ΔΔCt法計算B7-H3 mRNA相對表達量。

取上述3組細胞，應用康成公司的蛋白抽提試劑盒提取各組細胞的總蛋白， BCA法定量蛋白后采用蛋白質印跡法檢測B7-H3蛋白，以GAPDH為內參照。鼠抗人B7-H3單抗購自Bio Legend公司。ECL顯色、曝光、顯影后，采用灰度分析軟件半定量計算B7-H3蛋白表達量。

六、統計學處理

結 果

一、重組質粒的鑒定

轉染重組質粒的陽性菌落經PCR擴增，均獲得343 bp的條帶，轉染空載體的PCR擴增條帶片段為306 bp(圖1)。經測序，4個靶向B7-H3基因的shRNA重組質粒的shRNA編碼序列與設計的片段完全一致，表明重組干擾質粒構建成功(圖2)。

1：陰性對照組；2：空載體組；M：Maker；N：shRNA-C組；3～6：shRNA1、2、3、4組

圖1各組陽性菌落的質粒擴增片段

二、最佳干擾質粒的篩選

因293T細胞不表達Flag，而重組B7-H3過表達質粒是將目的基因B7-H3與Flag融合表達的，轉染重組干擾質粒的干擾效果通過Flag的表達抑制體現。質粒轉染293T細胞24 h后，各組熒光細胞數均在80%以上，36 h后的蛋白質印跡法檢測結果顯示shRNA4重組干擾質粒的干擾效果最佳(圖3)，確定用該干擾質粒進行慢病毒包裝。

三、穩定低表達B7-H3的PaTu8988細胞株的建立

重組慢病毒感染PaTu8988細胞，經sorting流式細胞儀分選純化提高陽轉細胞比例，即獲穩定低表達B7-H3的PaTu8988細胞株。經流式細胞儀檢測，GFP陽性表達率達96.8%(圖4)。穩定低表達B7-H3的PaTu8988細胞的B7-H3 mRNA及蛋白表達較shRNA-C組和空白對照組顯著下調，mRNA的抑制率達96.8%，蛋白抑制率達88.1%(圖5)。

a～d：shRNA1、2、3、4重組的質粒

圖3 各組轉染細胞的Flag蛋白表達

圖4穩定低表達B7-H3的PaTu8988細胞 (a：熒光顯微鏡 ×200)及其GFP表達(b：流式細胞儀)

圖5各組慢病毒感染后PaTu8988細胞的B7-H3蛋白表達

討 論

T細胞活化除需要T細胞受體轉導的第一信號外，還需要協同刺激分子轉導的第二信號。B7-H3為新發現的協同刺激分子中的成員，具有正向或負向調控T細胞的作用[1-4]。B7-H3在多種惡性腫瘤細胞中高表達且是患者預后不良的獨立因素[5-9]。研究發現，B7-H3在腫瘤中可能作為一種免疫逃逸通路存在，其表達導致T細胞介導的抗腫瘤免疫的下調[10]。也有學者發現，B7-H3高表達促進腫瘤侵潤和轉移[11-12]。因此推斷B7-H3在胰腺癌的發生、發展中也可能發揮著復雜的作用，其機制有待進一步研究。

近年發展起來的RNAi干擾技術具有高效性、穩定性、可傳遞性、特異性強等優勢。而且慢病毒載體不僅具有毒力低、轉染效率高、可轉染不同時相細胞、能夠攜帶大片段基因的優點，更重要的是能將目的基因整合到宿主細胞染色體中，并在子代中穩定表達，且具有較好的生物安全性[13-14]。本研究先從4個靶向B7-H3基因的shRNA中篩選出干擾效果最佳的shRNA序列，繼而構建RNA干擾重組慢病毒感染人胰腺癌細胞株PaTu8988，經流式細胞儀分選，獲得了穩定低表達B7-H3的細胞株，B7-H3 mRNA的表達抑制率達96.8%，蛋白表達抑制率達88.1%，為進一步研究B7-H3基因在胰腺癌發病及進展中的作用及其機制提供了實驗基礎。

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ConstructionofB7H3RNAilentiviralvectorandestablishmentofitsstablyinfectedhumanpancreaticcancerPaTu88cellline

ZHAOXin,ZHANGGuang-bo,LIZhi,GANWen-juan,ZHUDong-ming,ZHAOHua,ZHANGZi-xiang,LIDe-chun.

DepartmentofGeneralSurgery,FirstAffiliatedHospital,SoochowUniversity,Suzhou215006,China

Correspondingauthor：LIDe-chun,Email:dechunli.soochowedu@yahoo.cn

ObjectiveTo construct the B7-H3-RNAi lentiviral vector and establish a stably infected human pancreatic cancer PaTu88 cell line.MethodsAccording to genetic information of B7 H3 cDNA sequence provided by GenBank, 4 siRNA sequence targeting B7-H3 were designed. The corresponding pGCSIL-GFP recombinant plasmids (pGCSIL-GFP-B7-H3-shRNA) were constructed. Then both recombinant interference plasmid and over-expressing B7-H3 plasmid (pEGFP-N1-H3-1FLAG-GFP) were transfected into 293T cells. Western blot was used to detect the recombinant interference plasmid with best effect of interference. Then this plasmid underwent lentiviral packaging and was infected into PaTu8988 cells and a stably low-expression of B7-H3 cell line was established. Real-time quantitative PCR and Western blot were applied to measure the expression inhibition rate of B7-H3.ResultsLentiviral with the best gene silencing effect shRNA was infected into PaTu8988 cell line, and a PaTu8988 cell line, stably low-expressing B7-H3, was established, and the inhibitive rate of B7-H3 mRNA and protein expression were 96.8% and 88.1%, respectively.ConclusionsB7-H3-shRNA lentiviral vector is successively constructed and pancreatic cancer Patu8988 cell line which can stably low-express B7-H3 is established.

Pancreatic neoplasms； B7-H3； RNA interference； Lentivirus infections

2012-10-08)

(本文編輯：呂芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.02.009

國家自然科學基金(81001138)；江蘇省普通高校研究生科研創新計劃(CXZZ11_0125)；蘇州市科技計劃(SYS201120)；蘇州大學優秀博士學位論文選題立項(2011一般資助-14)

215006 蘇州，蘇州大學附屬第一醫院普外科(趙鑫、朱東明、趙華、張子祥、李德春)，介入科(李智)，病理科(干文娟)；臨床免疫研究室，江蘇省醫學重點實驗室，江蘇省臨床免疫研究所(張光波)

李德春，Email: dechunli.soochowedu@yahoo.cn