靶向人轉錄因子GLI1基因的RNAi真核表達載體的構建與鑒定

郭杰芳 高軍 龔燕芳 金晶 吳紅玉 滿曉華 李兆申

·論著·

靶向人轉錄因子GLI1基因的RNAi真核表達載體的構建與鑒定

郭杰芳 高軍 龔燕芳 金晶 吳紅玉 滿曉華 李兆申

目的利用pGCsi-U6-GFP質粒構建干擾人轉錄因子GLI1基因的小發夾RNA(shRNA)表達載體，并進行干擾活性鑒定。方法根據GenBank中GLI1cDNA的序列，設計并合成3條GLI1 siRNA，分別克隆至質粒載體pGCsi-U6-GFP中構建重組質粒，轉化大腸桿菌DH5a，擴增后提取質粒，行PCR及測序鑒定。脂質體轉染法將鑒定正確的3個重組質粒pGCsi-U6-GLI1siRNA-1、pGCsi-U6-GLI1siRNA-2、pGCsi-U6-GLI1siRNA-3及作為陰性對照質粒的pGCsi-U6-GLI1siRNA-C分別與過表達質粒pEGFP-N1-GLI1共轉染HEK293細胞株，48 h后收集細胞，半定量RT-PCR及蛋白質印跡法檢測各組細胞GLI1 mRNA及蛋白的表達，鑒定篩選出最佳干擾質粒。結果3個重組質粒pGCsi-U6-GLI1siRNA-1、pGCsi-U6-GLI1siRNA-2、pGCsi-U6-GLI1siRNA-3均擴增出預期大小(369 bp)的片段，經測序證實與設計合成的序列完全一致。3個重組質粒轉染HEK29細胞后細胞GLI1mRNA表達量分別為0.290±0.011、0.421±0.018、0.373±0.018，蛋白表達量分別為0.318±0.026、0.433±0.021、0.381±0.018，均顯著低于陰性對照質粒轉染細胞的0.834±0.022及0.818±0.024(P=0.000)。GLI1 mRNA表達抑制率分別達65.8%、50.7%、55.7%，蛋白表達抑制率分別為63.9%、48.3%、53.9%，以pGCsi-U6-GLI1siRNA-1的干擾作用最強。結論成功構建了靶向GLI1的shRNA表達載體，篩選出具有最佳干擾效果的質粒，為進一步研究GLI1基因功能奠定了基礎。

RNA干擾； shRNA； 轉錄因子； GLI1基因； Hedgehog信號通路

Hedgehog/GLI1信號通路的過度激活與人胰腺癌的發生、發展密切相關。轉錄因子GLI1是該通路的重要成員[1]，在該通路的信號轉導及致瘤過程中起著非常重要的作用。RNA干擾(RNA interference，RNAi)是一種高效、特異的基因沉默手段[2]。本研究應用分子克隆技術構建靶向GLI1的RNAi真核表達載體，為進一步研究GLI1基因的功能提供技術手段。

材料與方法

一、GLI1 siRNA的設計、篩選與小發夾RNA(shRNA)的合成

根據GenBank報告的GLI1cDNA全長序列(NM_005269)，利用Qiagen的siRNA設計軟件，按照Angela原則選出G/C含量在50%左右且符合要求的19-nt序列，進行BLAST匹配，從中篩選與GLI1以外的人類已知基因組沒有同源性的3條最佳序列：GLI1siRNA-1：5′-CTCCACAGGCATACAGGAT-3′；GLI1siRNA-2：5′-CCTCTGTCTACTCACCACA-3′；GLI1 siRNA-3：5′-GGCTCAGCTTGTGTGTAAT-3′。對于每條所選定的siRNA序列，設計、合成兩條shRNA插入模板寡核苷酸單鏈。模板鏈包括siRNA正義鏈與反義鏈，與中間的9個脫氧核苷酸的Loop結構(TTCAAGAGA)相連，后面接有RNA PolyⅢ聚合酶轉錄終止信號TTTTT。模板鏈兩端分別設有BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位點。同時合成陽性對照shRNA(shRNA-C)，shRNA片段由上海生工生物工程技術服務公司合成。

二、GLI1 shRNA 表達載體的構建與鑒定

將兩條模板單鏈與退火緩沖液混勻，置90℃ 4 min、70℃ 10 min、37℃ 20 min、10℃ 30 min使之形成帶黏末端的互補雙鏈shRNA寡核苷酸。pGCsi-U6-GFP質粒(上海吉凱基因公司)經BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切后分別與3個shRNA以1∶58濃度比在T4 DNA連接酶作用下置16℃連接6 h。連接產物轉化入大腸桿菌 DH5α感受態細胞，在含氨芐青霉素的LB平板上37℃培養過夜，挑取陽性克隆，抽提質粒，PCR鑒定。PCR上游引物5′-CAA-GGTCGGGCAGGAAGAG-3′，下游引物5′-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3′。插入shRNA片段的重組質粒擴增產物應為369 bp，空載體擴增產物應為322 bp。經PCR鑒定初步正確的重組質粒送上海英駿公司測序。測序正確的3個重組質粒分別命名為pGCsi-U6-GLI1siRNA-1、pGCsi-U6-GLI1siRNA-2、pGCsi-U6-GLI1siRNA-3。

三、質粒轉染

取對數生長期HEK 293細胞(購自中科院細胞庫)接種于6孔培養板，培養于不含抗生素的DMEM培養液。待細胞長至約90%融合時采用LipofectamineTM2000轉染。實驗分5組，1～4組分別共轉染過表達質粒pEGFP-N1-GLI1(前期合成)和重組質粒pGCsi-U6-GLI1siRNA-1、pGCsi-U6-GLI1siRNA-2、pGCsi-U6-GLI1siRNA-3和陰性對照pGCsi-U6-siRNA-C(上海吉凱基因技術公司，在脊椎動物細胞內表達不干擾任何內源性基因的shRNA)，第5組僅轉染pEGFP-N1-GLI1。各質粒DNA量均為4 μg。轉染4 h后棄轉染復合物，加入含5%FBS的DMEM繼續培養48 h。

四、轉染細胞GLI1 mRNA檢測

收集轉染的細胞，Trizol試劑盒抽提總RNA，反轉錄成cDNA，行半定量RT-PCR法檢測GLI1 mRNA。GLI1上游引物5′-TGCCTTGTACCCTCCTCC-CGAA-3′，下游引物5′-GCGATCTGTGATGGATGA-GATTCCC-3′，擴增片段284 bp；內參β-actin上游引物5′-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3′，下游引物5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′，擴增片段185 bp。擴增條件：94℃ 2 min，94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，循環30次，72℃延伸10 min。凝膠電泳分析擴增產物，復日凝膠成像系統行半定量灰度掃描，以目的條帶與內參條帶灰度比值表示mRNA表達量。實驗重復3次，取均值。

五、轉染細胞GLI1蛋白檢測

取轉染細胞，超聲破碎后12 000 r/min離心5 min，取上清，應用BCA法檢測總蛋白濃度。采用蛋白質印跡法檢測GLI1蛋白，以β-actin為內參。兔抗人GLI1一抗(Santa Crus公司)工作濃度1∶1000，羊抗兔 IgG-HRP二抗工作濃度1∶1000，最后ECL化學發光顯影，光密度掃描系統掃描，以目的條帶與內參條帶的灰度比值表示蛋白表達量。實驗重復3次，取均值。

六、統計學處理

結 果

一、GLI1 shRNA 表達載體的構建與鑒定

3個插入GLI1 shRNA片段的重組質粒pGCsi-U6-GLI1siRNA-1、pGCsi-U6-GLI1siRNA-2、pGCsi-U6-GLI1siRNA-3經RT-PCR擴增均擴增出369 bp的片段，與pGCsi-U6-siRNA-C的擴增產物大小一致(圖1)。重組質粒送測序分析，確認插入片段的序列與設計合成的shRNA序列完全一致(圖2)。

M：Mark；1：空白對照；2：pGCsi-U6-GFP；3：pGCsi-U6-siRNA-C；4: pGCsi-U6-GLI1siRNA-1；5：pGCsi-U6-GLI1siRNA-2；6: pGCsi-U6-GLI1siRNA-3

圖1各表達載體PCR擴增產物電泳圖

A：pGCsi-U6-GLI1 siRNA-1；B：pGCsi-U6-GLI1 siRNA-2；C：pGCsi-U6-GLI1siRNA-3

圖23個GLI1 shRNA重組質粒測序結果

二、轉染細胞GLI1 mRNA的表達

轉染pGCsi-U6-GLI1siRNA-1、pGCsi-U6-GLI1 siRNA-2、pGCsi-U6-GLI1siRNA-3、pGCsi-U6-siRNA-C、pEGFP-N1-GLI1細胞的GLI1mRNA相對表達量分別為0.290±0.011、0.421±0.018、0.373±0.018、0.834±0.022、0.839±0.027，相對于轉染pEGFP-N1-GLI1的細胞，轉染pGCsi-U6-GLI1siRNA-1、pGCsi-U6-GLI1siRNA-2、pGCsi-U6-GLI1siRNA-3的細胞GLI1 mRNA表達抑制率分別為65.8%、50.7% 及55.7%(P=0.000，圖3)。其中以轉染pGCsi-U6-GLI1 siRNA-1的細胞GLI1 mRNA的表達抑制率最高。

1：pGCsi-U6-GLI1 siRNA-1組；2：pGCsi-U6-GLI1siRNA-2組；3：pGCsi-U6-GLI1 siRNA-3組；4：pGCsi-U6-siRNA-C組；5：pEGFP-N1-GLI1組

圖3各質粒轉染組細胞GLI1mRNA的表達

三、轉染細胞GLI1蛋白的表達

轉染pGCsi-U6-GLI1siRNA-1、pGCsi-U6-GLI1 siRNA-2、pGCsi-U6-GLI1siRNA-3、pGCsi-U6-siRNA-C、pEGFP-N1-GLI1-NC細胞的GLI1蛋白相對表達量分別為0.318±0.026、0.443±0.021、0.381±0.018、0.818±0.024、0.831±0.031，相對于轉染pEGFP-N1-GLI1的細胞，轉染pGCsi-U6-GLI1 siRNA-1、pGCsi-U6-GLI1 siRNA-2、pGCsi-U6-GLI1 siRNA-3的細胞GLI1蛋白表達抑制率分別為63.9%、48.3% 、53.9%(P值均=0.000，圖4)，其中以轉染pGCsi-U6-GLI1siRNA-1細胞的表達抑制率最高，與RT-PCR的結果相一致。

1：pGCsi-U6-GLI1siRNA-1組；2：pGCsi-U6-GLI1siRNA-2組；3：pGCsi-U6-GLI1siRNA-3組；4：pGCsi-U6-siRNA-C組；5：pEGFP-N1-GLI1-組

圖4各組細胞GLI1蛋白的相對表達量

討 論

近年來國內外研究發現Hedgehog信號通路的異常激活與人胰腺癌的發生、發展密切相關[3]。Thayer等[4]利用轉基因技術使小鼠胰腺內胚層異常表達Hedgehog信號通號的上游成員SHH，結果胰腺上皮出現類似上皮內瘤變的異常管狀結構，且這些異常管狀結構含有K-ras基因突變及HER-2/neu的過度表達，提示該通路與胰腺癌的癌前病變密切相關。我們前期研究也發現，5株人胰腺癌細胞株均不同程度表達Hedgehog信號通路的GLI1及PTCH1，胰腺癌組織中PTCH、SMO、GLI1的表達水平及表達陽性率均顯著高于相應的癌旁正常組織[5-7]。這些結果均表明，Hedgehog通路在胰腺癌的發生及惡性生物學特性的維持中起著非常重要的作用。GLI1作為該通路末端具有很強活性的轉錄激活因子，它直接調控著靶基因的轉錄，在該通路的信號轉導中起著重要作用。因此，深入研究GLI1基因的功能將有助于探討Hedgehog通路在致胰腺癌中的作用機制。

近年來發展迅速的RNAi技術因其高特異性、高效性、作用迅速等特點，在腫瘤的基因功能研究方面展現出了不可比擬的優勢[8-9]。RNAi技術的關鍵環節是如何高效地將siRNA導入靶組織或細胞并使之發揮長期、穩定的抑制作用[10]。以往獲得siRNA的方法主要有體外制備及體內轉錄兩種，但這兩種方法獲得siRNA性質不穩定，易被RNA酶降解，抑制作用短暫，且體外合成的siRNA的量往往也不能滿足體內實驗的要求，因此應用價值有限。而siRNA表達載體性質穩定，轉染率較高，在細胞內能較長時間表達siRNA，干擾效果較持久，故在腫瘤基因研究中潛力更大[11]。

為了進一步探討GLI1在胰腺癌發生、發展中的作用，本實驗在前期研究基礎上，將GLI1作為研究靶點，設計3條針對GLI1基因的siRNA序列，并合成shRNA寡核苷酸鏈，將其定向克隆入pGCsi-U6-GFP質粒，經RT-PCR及測序分析，證實靶向干擾GLI1基因的表達質粒構建成功。將重組質粒轉染HEK293細胞后GLI1mRNA及蛋白的表達均被抑制，以pGCsi-U6-GLI1 siRNA-1質粒的抑制作用最顯著，為后續研究GLI1基因的功能及深入探討Hedgehog/ GLI1信號通路在胰腺癌發生、侵襲、轉移中的作用奠定了基礎。

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ConstructionandidentificationofRNAieukaryoticexpressionvectorstargetinghumantranscriptionfactorglioma-associatedoncogenehomolog1

GUOJie-fang,GAOJun,GONGYan-fang,JINJing,WUHong-yu,MANXiao-hua,LIZhao-shen.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

Correspondingauthor：LIZhao-shen,Email：zhsli@81890.net

ObjectiveTo construct RNAi eukaryotic expressing vectors of human transcription factor glioma-associated oncogene homolog 1 (GLI1) with pGCsi-U6-GFP plasmid and to identify its activity in interfering GLI1.MethodsThree GLI1siRNA targeting GLI1 were designed and synthesized according to the GLI1cDNA sequence in GeneBank, and then were cloned into pGCsi-U6-GFP to construct the recombinant plasmids, and transformed into E.coli DH5a, then it was amplified and plasmids were extracted, which were further confirmed by PCR reaction and DNA sequencing. pGCsi-U6-siRNA-C was negative as control wector. Then recombinant plasmids pGCs-U6-GLI1siRNA-1, pGCs-U6-GLI1siRNA-2, pGCs-U6-GLI1siRNA-3 pGCsi-U6-siRNA-C and a eukaryotic over-expression vector pEGFP-N1-GLI1 were co-transfected into HEK293 cells by Lipofectamine 2000 respectively. The cells were collected at 48 h after transfection. Semi-quantitative RT-PCR and Western Blot were performed to detect the expression of GLI1 mRNA and protein to screen the optimal vector which had the best interfering effect.ResultsA 369 bp fragment was amplified from all three recombinant plasmids, (pGCs-U6-GLI1siRNA-1,pGCs-U6-GLI1siRNA-2,pGCs-U6-GLI1siRNA-3),showing that synthesized shRNA oligonucleotide fragments were correctly inserted into three recombinant plasmids, which were further confirmed by sequencing. Expression levels of GLI1mRNA and protein in cells in pGCs-U6-GLI1siRNA-1, pGCs-U6-GLI1siRNA-2, pGCs-U6-GLI1siRNA-3 were 0.290±0.011,0.421±0.018,0.373±0.018,and 0.318±0.026,0.443±0.021,0.381±0.018, which were significantly lower than those in negative control group (0.834±0.022,0.818±0.024,P=0.000), the inhibitory rates were 65.8%,50.7%,55.7%, and 63.9%,48.3%,53.9%. The interfering efficacy of pGCs-U6-GLI1siRNA-1 was the strongest among the three recombinant plasmids.ConclusionsRNAi eukaryotic vectors pGCs-U6-GLI1siRNA-1, pGCs-U6-GLI1siRNA-2, pGCs-U6-GLI1siRNA-3 are successfully constructed and the optimal vector is identified, and this can provide a solid experimental foundation for further functional study of GLI1 gene.

RNA interference； Short hairpin RNA； Transcription factor； GLI1 genes； Hedgehog signaling pathway

2013-01-14)

(本文編輯：呂芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.02.011

國家自然科學基金(81101575)；上海市科委醫學引導類項目(114119a6700)

200433 上海，第二軍醫大學長海醫院消化內科

李兆申，Emial：zhsli@81890.net