3-MA對急性壞死性胰腺炎大鼠肺損傷的保護作用

袁小凌 劉潔 陳衛昌

·短篇論著·

3-MA對急性壞死性胰腺炎大鼠肺損傷的保護作用

袁小凌 劉潔 陳衛昌

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)早期就可引起全身炎癥反應綜合征(SIRS)，胰腺壞死進而并發多器官功能障礙(MODS)[1-2]。急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是其中最常見的并發癥，可迅速惡化演變為急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)，成為SAP早期病死的主要原因。自噬在急性胰腺炎中的作用是近年來胰腺炎研究的新領域。然而在哺乳動物中關于自噬發生的機制尚不明確，其在急性胰腺炎肺損傷中的作用機制也不明確。本研究采用大鼠急性壞死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis, ANP)模型觀察自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)對ANP并發的肺損傷的保護作用。

一、材料和方法

1．實驗動物及分組：健康雄性Sprague-Dawley大鼠54只，體重200～250 g，購自蘇州大學動物實驗中心。按數字表法隨機分成假手術組、ANP組、3-MA干預組，每組18只。采用改良的Aho法[3]制備ANP模型，即以0.1 ml/min的速度向胰膽管內逆行注入5%?；悄懰徕c。3-MA組在建模前30 min腹腔注射3-MA 15 mg/kg體重(Sigma公司)。假手術組開腹翻動胰腺后即關腹。各組分別于術后3、6、12 h腹主動脈抽血，分離血清置-80℃保存，將大鼠處死，留取胰腺、肺組織，40 g/L甲醛固定。

2．血淀粉酶、IL-1β測定：血淀粉酶采用全自動生化分析儀檢測。血IL-1β采用ELISA方法檢測，試劑盒購自杭州聯科生物公司，按試劑盒說明書操作。

3．胰腺、肺組織病理學檢查：取固定的各組胰腺、肺組織標本，石蠟包埋，切片，HE染色，采用盲法由?？漆t師在光鏡下閱片。

4．胰腺、肺組織Beclin-1檢測：采用免疫組織化學法檢測。兔抗鼠Beclin1抗體購自SANTA CRUZ公司，1∶200稀釋，羊抗兔IgG-HRP購自北京博奧森生物公司。最后DAB顯色、蘇木素復染、脫水、透明、中性封片，顯微鏡觀察。以胞質出現棕黃色顆粒細胞為陽性細胞，隨機觀察5個高倍視野，根據陽性細胞百分比和染色深度進行評估。陽性細胞：<10%為0分，10%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；染色深度：無染色0分，淡黃色1分，黃色2分，棕黃色3分。兩分值相加為總評分。

5．統計學處理：使用SPSS17.0統計軟件處理。數據以表示，多組間比較采用單因素方差分析(One Way ANOVA)，與假手術組比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異具有統計學意義。

二、結果

1．胰腺、肺組織病理學改變：假手術組大鼠胰腺、肺組織無明顯變化。ANP組3 h時胰腺輕度充血水腫，點片狀壞死及少量血性腹水，6 h時病理改變加重，12 h時胰腺大片壞死，出現大量皂化斑及血性腹水；鏡下見胰腺腺泡水腫、腺泡結構破壞、消失，葉間隔、小葉間隔及腺泡間隔顯著增寬，腺泡細胞不同程度變性壞死，周圍出血，隨時間的延長，病變呈進行性加重。ANP組大鼠均有不同程度肺水腫，肺表面散在出血點，胸腔少量積水，12 h有局部小片狀紫褐色肺不張；鏡下見肺泡及肺間質水腫，間質內紅細胞和炎性細胞滲出，隨時間延長加重，肺泡壁破裂，肺泡塌陷實變，大量炎性細胞浸潤。3-MA處理組胰腺、肺組織病理變化較ANP組明顯減輕(圖1)。

圖1假手術組(a)、ANP組(b)、3-MA組(c)大鼠術后12 h的胰腺(上)、肺組織(下)病理學改變(HE ×400)

2．血淀粉酶、IL-1β水平變化：ANP組血淀粉酶、IL-1β水平隨時間延長顯著增高，較假手術組均顯著升高。3-MA組血淀粉酶在6、12 h，IL-1β在3、6、12 h均較ANP顯著降低，但仍顯著高于假手術組(表1)。

3．胰腺及肺組織Beclin-1蛋白表達的變化： 假手術組胰腺組織僅少量腺泡細胞表達Beclin-1，肺組織僅少量肺泡間質細胞表達Beclin-1。ANP組各時點胰腺及肺組織Beclin-1蛋白表達明顯升高(t值分別為10.805、10.009、15.513、9.311、12.124、16.658，P值均<0.01)。3-MA組各時點Beclin-1蛋白表達顯著低于ANP組(t值分別為5.853、6.892、9.390、7.129、8.660、10.805，P值均<0.01)，但仍顯著高于假手術組(t值分別為2.791、3.468、4.497、1.391、2.673、3.464，P值均<0.05，表2，圖2)。

表1 各組大鼠血淀粉酶、IL-1β水平的變化

注：與假手術組比較，aP<0.05；與ANP組比較，bP<0.015

表2 各組大鼠肺、胰腺組織Beclin-1的表達分值

注：與假手術組比較，aP值均<0.01；與ANP組比較，bP值均<0.05

圖2假手術組(a)、ANP組(b)、3-MA組(c)大鼠術后12 h的胰腺(上)、肺組織(下)Beclin-1蛋白表達(免疫組化 ×400)

討論自噬是細胞利用溶酶體降解自身受損的細胞器和大分子物質的過程，是真核細胞特有的生命現象，主要通過對長壽命蛋白以及細胞器的降解和再利用，對細胞進行調節[4]。自噬在急性胰腺炎中作用是近年來胰腺炎研究的新領域。Beclin-1是酵母ATG6的同系物，也是哺乳動物參與自噬的特異性基因[5]，通過與Ⅲ型磷脂酰肌醇三磷酸激酶(ClassⅢPI3K)形成復合物參與自噬體的形成，從而使磷脂肌醇磷酸化，產生PI3P，在自噬前體復合物的形成及自噬小體膜的來源中發揮重要作用[6-7]。3-MA是磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)的抑制劑，自噬體的形成依賴于ClassⅢPI3K，ClassⅢPI3K可磷酸化磷脂酰肌醇(PtdIns)，生成3-磷酸磷脂酰肌醇(PtdIns3P)。PtdIns3P募集胞質中含-FYVE-或-PX-基序的蛋白質，用于自噬體膜的形成。因此，3-MA是目前應用較成熟的自噬抑制劑。

Takahashi等[8]和Ohmuraya等[9]將小鼠的自噬相關基因Atg5敲除后，應用雨蛙素誘導出急性胰腺炎，結果Atg5-/-小鼠胰腺腺泡細胞中自噬減少，胰蛋白酶原激活減少，急性胰腺炎的嚴重程度大大減輕，提示自噬或者某些相關蛋白與胰蛋白酶原激活有關[10]。本研究結果顯示，ANP大鼠胰腺和肺組織中自噬相關蛋白Beclin-1的表達隨時間延長明顯升高，與病理變化、炎癥因子IL-1β的變化一致。3-MA干預后胰腺和肺組織的Beclin-1蛋白表達下降，病理改變減輕，同時血清淀粉酶、炎癥因子IL-1β水平降低，但仍高于假手術組，提示3-MA可能通過PI3K/Akt途徑抑制自噬，在一定程度上緩解ANP并發急性肺損傷的嚴重程度。

雖然自噬激活在一定程度上減輕ANP并發的肺損傷，但盲目抑制或阻斷自噬可能會對機體造成不可預料的損傷。因此，進一步深入研究自噬信號轉導通路及如何調控自噬，對改善急性胰腺炎肺損傷的臨床治療效果有非常重要的意義。

[1] 李永渝.重癥急性胰腺炎發病機制研究進展.中華外科雜志,2009,47:1478-1480.

[2] Kyl?np?? ML,Repo H,Puolakkainen PA.Inflammation and immunosuppression in severe acute pancreatitis.World J Gastroenterol,2010,16:2867-2872.

[3] 張明鈞,姚瑋艷，袁耀宗，等.腸壁穿刺逆行胰膽管注射?；悄懰徕c重癥急性胰腺炎造模.上海交通大學學報(醫學版),2006,19:5720-5728.

[4] Ladero Quesada JM.Role of the peritoneum in the pathogenesis of acute pancreatitis-associated lung injury.Rev Esp Enferm Dig,2004,96:521-526.

[5] Duprez L,Wirawa E,Vanden Berghe T,et al.Major cell death pathways at a glance.Microbes Infect, 2009,11:1050-1062.

[6] Meijer AJ,Codogno P.Regulation and role of autophagy in mammalian cells.Int J Biochem Cell Biol, 2004,36:2445-2462.

[7] Friedman LS, Ostermeyer EA, Lynch ED,et al.The search for BRCA1. Cancer Res, 1994,54: 6374-6382.

[8] Takahashi Y, Coppola D, Matsushita N. Bif-1 interacts with Beclin 1 through UVRAG and regulates autophagy and tumorigenesis. Nat Cell Biol, 2007, 9: 1142-1151.

[9] Ohmuraya M ,Yamamura K．Autophagy and acute panereatids：a novel autophagy theory for trypsinogen activation．Autophagy,2008,4：1060-1062.

[10] Hashimoto D,Ohmuraya M,Hirota M,et al.Involvement of autophagy in trypsinogen activation within the pancreatic aeinar cells．J Cell Biol,2008,181:1065-1072.

2012-10-23)

(本文編輯：屠振興)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.02.017

215006 蘇州，蘇州大學附屬第一醫院消化內科

陳衛昌，Email:weichangchen@126.com