微波輔助水提梓樹根皮中抑菌成分的研究

邵金華，黃國文，劉 恭

湖南科技學院生化系，湖南永州 425100

梓樹皮為紫葳科梓屬喬木植物梓樹(Catalpa ovata G.Don)的皮，又名梓白皮、梓皮、梓木白皮、梓根白皮、土杜促，可入藥，據《本草綱目》記載，具有清熱、解毒、殺三蟲和利尿的功能［1，2］。梓屬植物中主要的化學成分有環烯醚萜類成分［3-5］、萘醌類成分［6，7］、苯酚類化合物［8］及一種新的苯乙烯雙糖苷類［9］化合物。目前，國內外對梓樹在醫藥臨床方面的研究報告很多［10］，而對其在抗菌作用及抗菌成分方面的報道卻很少。梓樹的研究主要集中在梓樹幼苗的培育，梓樹果實，梓樹花藥及梓樹葉有效成分的研究上［11］，而對其根皮在抗菌作用及抗菌成分方面報道較少。本實驗以梓樹根皮為實驗材料對其抗菌活性進行了系統研究，并對其結果進行整理。旨在為植物抗菌化合物的開發利用提供一個新的資源，同時也為梓屬植物資源的開發利用提供一個新思路，對于日益嚴峻的藥品安全問題多劈一條路。

1 材料、試劑及儀器

1.1 材料

梓樹根皮(采自湖南省永州市祁陽縣)

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)(來自學校微生物實驗室)

1.2 試劑

牛肉膏(生化試劑)、蛋白胨(生化試劑)、氯化鈉(分析純)、氫氧化鈉(分析純)、瓊脂(生化試劑)、70%乙醇(分析純)等。

1.3 儀器

XH-MC-1實驗室微波合成儀(北京祥鵠科技發展有限公司)、01J2003-04型立式壓力蒸汽滅菌器筒(上海博迅實業有限公司)、DZF-6051型真空干燥箱(上海賀德實驗設備有限公司)、SW-CJ-2F潔凈工作臺(蘇州安泰空汽技術有限公司)、HWS智能型恒溫恒濕培養箱(寧波市科技園區新江南儀器有限公司)等。

2 實驗方法

2.1 原料處理

將梓樹皮用毛刷刷洗干凈，用剪刀將其剪碎，然后放入烘箱中在65℃條件下將其烘干，用植物粉碎機將其粉碎，最后過40目篩(一定要把絨毛刷干凈)。

2.2 供試菌株和菌懸液的制備

將枯草芽孢桿菌首先活化，然后轉接入制備好的試管斜面上，于37℃恒溫培養箱內培養24 h。用接種環挑取一環菌體放入裝有10 mL無菌水的錐形瓶中，充分搖勻，制成菌懸液，備用。用1 mL無菌吸管吸取1 mL已充分混勻的枯草芽孢桿菌菌懸液，精確地放0.5 mL至10-1的試管中，此即為10倍稀釋。將多余的菌液放回原菌液中。另取一支1 mL吸管插入10-1試管中來回吹吸菌懸液三次，進一步將菌體分散、混勻，用此吸管吸取10-1菌液1 mL，精確地放0.5 mL至10-2試管中，此即為100倍稀釋。其余依次類推。在每個倒入培養基的平板中分別加入200 uL已制備好的10-5枯草芽孢桿菌菌懸液，用涂布棒將其均勻涂抹在培養基的平板上，放置一段時間后備用。

2.3 抑菌活性的測定方法

用打孔機將濾紙圓片打成4 mm的圓片，在烘箱中經高壓滅菌后，將其放在提取溶液中和空白對照的水中浸泡30 min，瀝去多余的試液，將濾紙片用無菌鑷子夾取，放入涂好菌液的培養基平板上。每皿成“+”形對稱放置4張圓片，平行做三組，剩余一組為對照組。置于37℃恒溫培養箱內培養24 h。培養結束后，用游標卡尺測量培養基中抑菌圈的直徑(除去濾紙片的直徑)。

2.4 單因素試驗

用電子天平精確稱取梓樹皮2 g，若干份，分別在不同微波功率、料液比、微波提取時間、微波提取溫度條件下提取，收集濾液，過濾。用干熱滅菌過的濾紙片蘸取提取液和空白液，瀝干后將其放入涂有枯草芽孢桿菌的培養基平板上，在培養箱中37℃下培養48 h后，測定抑菌圈的大小，以抑菌圈的直徑大小為指標來研究該因素對抑菌化合物提取的影響。

2.5 正交實驗

根據單因素實驗的結果，以等量的提取劑(水)為空白對照，以微波功率、料液比、微波提取時間、溫度為因素進行L9(34)正交實驗，根據正交實驗結果確定最佳工藝。

3 結果與分析

3.1 單因素實驗

3.1.1 微波功率對抑菌化合物的影響

在提取時間為9 min、料液比為1∶20、溫度為50℃時，微波功率對抑菌化合物提取的影響如圖1所示。從圖1可以看出:微波功率在100～300 W之間，隨著功率的增加，抑菌圈的直徑明顯增大，而微波在300～500 W之間，抑菌圈直徑的大小隨著功率的增大反而減小?？梢姴⒉皇俏⒉üβ试礁邔σ志衔锏奶崛≡胶?，由此可得微波功率在300 W時，對梓樹皮中抑菌化合物的提取最好.

圖1 微波功率對抑菌化合物提取的影響Fig.1 The effect of microwave power on extraction of antibacterial compounds

3.1.2 料液比對抑菌化合物提取的影響

在提取時間為9 min、微波功率為300 W、溫度為50℃時，料液比對抑菌化合物提取的影響如圖2所示。從圖2可以看出，料液比在1∶10～1∶15之間，隨著料液比的增大，抑菌圈的直徑增大，而在1∶15～1∶30之間，抑菌圈直徑的大小隨著料液比的增大反而明顯減小。一般來說，料液比越大，即溶劑用量越大，抑菌化合物得率也隨之增大，試驗結果顯示當溶劑用量達到一定值后，得率降低，此時提取物質已基本提取完全。且過大的料液比會造成溶劑和能源的浪費，因此從降低成本等綜合考慮，單因素試驗確定料液比為1∶15(g/mL)比較合理。

圖2 料液比對抑菌化合物提取的影響Fig.2 The effect of extraction time on extraction of antibacterial compounds

3.1.3 提取時間對抑菌化合物提取的影響

在料液比為1∶15、微波功率為300 W、溫度為50℃時，提取時間對抑菌化合物提取的影響如圖3所示。從圖3可以看出，隨著微波時間的增加，抑菌化合物抑菌圈顯著提高.微波時間為9 min時得率達到最大，隨后抑菌化合物抑菌圈不斷下降(圖3)。因此.最佳微波處理時間為9 min.原因可能是由于被微波輻射極性分子在電磁場中快速轉向，產生相互摩擦，引起胞內溫度迅速升高，快速高溫使內部壓力超過細胞空間膨脹能力，導致細胞內細胞器被破壞，加快促進抑菌化合物的擴散和滲透.但微波的強熱效應長時問作用后，導致抑菌化合物發生分解。

圖3 提取時間對抑菌化合物提取的影響Fig.3 The effect of extraction time on extraction of antibacterial compounds

3.1.4 溫度對抑菌化合物提取的影響

在料液比為1∶15、微波功率為300 W、提取時間為9 min時，溫度對抑菌化合物提取的影響如圖4所示。從圖4可以看出，溫度在30～40℃之間，隨著溫度的升高，抑菌圈的直徑增大，繼續升高溫度，抑菌圈直徑的大小隨著提取溫度的升高反而減小。因為，溫度的升高，降低了提取液的黏度，增大了擴散系數，增大抑菌化合物溶解度，提高了提取率。溫度為40℃時抑菌化合物抑菌圈達到最大，繼續升高溫度，提取率反而下降。

圖4 浸提溫度對抑菌化合物提取的影響Fig.4 The effect of temperature on extraction of antibacterial compounds

3.2 正交實驗

在單因素試驗基礎上，對微波功率、微波萃取時間、提取溫度和料液比4個因素進行了L9(34)正交試驗，每個試驗做3次重復。其因素水平見表1，正交試驗結果見表2，方差分析見表3。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels

表2 L9(34)正交試驗Table 2 Orthogonal test L9(34)

7 400 6 1∶20 40 12.1 8 400 9 1∶10 50 13.4 9 400 12 1∶15 30 14.5 K1 13.17 11.97 13.73 12.87 K2 14.03 13.27 13.53 14.07 K3 13.33 15.30 13.27 13.60極差R 0.86 3.33 0.46 1.20主次順序 B＞D＞A＞C優水平 A2 B3 C1 D2優組合 A2B3C1D2

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

由表2中的極差分析可知，影響梓樹皮中抑菌化合物提取主次順序為:B＞D＞A＞C，最優組合為:A2B3C1D2，即微波萃取時間＞提取溫度＞微波功率＞料液比。此順序同方差分析的結果一致(見表3)。從方差分析的結果可以看出，微波提取時間對抑菌化合物提取有及極顯著的影響，提取溫度對抑菌化合物的提取有顯著影響，料液比和微波功率對抑菌化合物的提取影響不顯著。由此得出，提取梓樹皮中抑菌化合物的最佳工藝條件為:微波功率300 W，提取時間12 min，料液比1∶10，溫度40℃。由于正交表中沒有此組合，因此采用此提取條件進行驗證試驗。

3.3 最佳條件的驗證試驗

按照上述最佳工藝條件A2B3C1D2制備三份供試液，進行驗證試驗。結果測得梓樹皮中抑菌化合物的平均抑菌直徑為17.22 mm，由此證明該方法穩定可行。

4 結論

微波輔助提取梓樹根皮中活性物質的正交試驗中，4個影響因素的主次順序為:微波萃取時間＞提取溫度＞微波功率＞料液比。

通過正交試驗得到最佳的提取工藝條件為:微波功率300 W，提取時間12 min，料液比1∶10，溫度40℃;采用此條件試驗，抑菌化合物的抑菌直徑可達17.22 mm。

微波輔助提取法具有簡單、省時、產率高的優點，為梓樹根皮的深入開發利用提供了新的技術途徑。

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