黃連木葉提取物抗氧化活性及相關毒性、抗毒性研究

張 旋，湯明禮，鄧冠軍，陳連運，吳麗芳*

1安徽大學生命科學學院，合肥 230039;2中國科學院離子束生物工程學重點實驗室，國家林業局能源林研究中心(合肥)，合肥 230031

植物資源在傳統藥物尤其是中醫藥方面有著廣泛的應用，而且隨著人們對人工合成添加物副作用認識的不斷深刻，對天然來源的食品添加劑、化妝保健防護品、藥物等的需求也越來越旺盛［1，2］。青蒿素、黃連素、喜樹堿、紫杉醇等國內外知名藥物都是從植物提取物中分離純化獲得。在天然提取物方面，黃酮(flavonoids)、多酚(polyphenol)、單寧(tannic)等發展勢頭迅猛。植物多酚、黃酮、單寧等廣泛存在于植物體內，如皮、根、莖、葉、果實中，目前尚不能人工合成。已有研究表明，植物黃酮、多酚等具有較強的抗氧化、抗菌抑菌、抗突變、抗輻射及抗癌和抗老化等功效。攝取一定量的植物多酚能夠有效地預防和抑制疾病的發生［3-5］。傳統的植物提取物多依賴糧油作物、茶葉、水果等。但是，隨著此類提取物的用量和應用范圍的擴大，已經很難滿足日益增長的需要，因此，開發新的多酚資源就顯得尤為重要。

黃連木(Pistacia chinensis Bunge)別名楷木，為漆樹科落葉木本油料及用材樹種，由于其果實含油量高而且比較適合轉化為生物柴油而被定位為中國發展木本生物能源的主要樹種之一［6］。另外，黃連木由于在我國分布廣，而且耐旱、耐鹽堿、耐貧瘠、適應性強，可以作為綠化造林的優選樹種進行生態修復、荒山沙地鹽堿地治理，同時也是很好的道路景觀樹種。黃連木作為藥物及食物應用在我國有著廣泛而悠久的歷史，對痢疾、牛皮癬、炎癥反應、風濕等有明顯的治療作用，其果實壓榨的油是貧困山區人們的主要食用油之一，其花和嫩芽可以制作茶葉和腌制食品。前期的研究表明，黃連木的葉、果實、根及餅粕等不同部位均富含黃酮、單寧、多酚類物質［7-9］，針對黃連木葉進行相關生物活性物質提取分離，并對其生物學功能進行深入挖掘，是黃連木綜合開發利用的一個非常有潛力的方向，尤其是與生物柴油聯產，更能充分提高黃連木的綜合利用價值。

本文對黃連木葉活性成分提取物的黃酮含量進行檢測，采用化學方法初步確定其抗氧化活性，并利用SOS-Lux體系對提取物的基因毒性和抗基因毒性進行研究，期望為黃連木生物活性成分提取、分離及相關應用提供理論基礎和實踐方法。

1 材料與方法

1.1 菌種、材料、試劑

黃連木葉片于2011年7月采自合肥市郊區科學島(作者單位所在地)，由國家林業局能源林研究中心(合肥)鑒定。鮮葉采集后立即120℃殺青處理5～10 min，50℃以內烘干，用粉碎機打碎成均勻顆粒，過篩，-20℃密封保存備用。

DPPH(1，1-二苯基-2-苦基肼自由基)為 Sigma公司產品;L-抗壞血酸(VC)為國藥集團化學試劑有限公司產品;絲裂霉素C(MMC)購自Roche中國公司;蘆丁(Rutin)和單寧酸(Gallic acid)來自成都瑞芬思生物科技有限公司。無水乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯均為國產分析純試劑。

菌種:Salmonella typhimurium菌種(Sal94，pRecA::LuxCDABE tolCCCmRAmpR)由以色列的Shimshon Belkin(The Hebrew University of Jerusalem)教授慧贈。

1.2 儀器與設備

Nikon D90單反相機、OLYMPUS顯微鏡BH-2、DP72型CCD、UV-2550型紫外可見分光光度計(島津公司)、離心機(sigma)、發光儀GLOMAX 20/20、循環水真空泵(予華儀器有限責任公司)、機械粉碎機(上海嘉定糧油儀器有限公司)、RE-52AA旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)、電熱恒溫水槽(上海躍進醫療器械廠)、超聲波清洗器(合肥金尼克機械制造有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 黃連木葉活性物質的提取

黃連木葉粗黃酮的提取工藝流程如下:

黃連木葉片粉末→50%乙醇溶液浸提→超聲處理→抽濾→離心→收集上清液→合并濾液→乙酸乙酯萃取→減壓蒸餾→真空干燥→粗提物粉末→成分含量檢測。

取5 g粉碎后的黃連木葉，按照1∶20料液比加入100 mL乙醇溶液(50%)，70℃水浴鍋中先浸提30 min，然后超聲輔助提取20 min，布氏漏斗抽濾，重復此過程一次，合并濾液，常溫下4500 rpm離心，減壓蒸餾減少溶液體積，等體積乙酸乙酯萃取兩次，萃取液減壓蒸餾，真空干燥得到粉末狀粗提物。

1.3.2 粗提物總黃酮含量檢測

總黃酮含量的檢測參照裴詠萍等的方法［10］，以蘆丁為標準品，結果以蘆丁當量表示。樣品配制濃度為0.4 mg/mL，30 mL乙醇溶液(70%)加入8 mL待測樣品溶液，加入0.1 mol/L的氯化鋁2 mL，然后加入CH3COONa-CH3COOH混合液(pH 6.3)2 mL，用70%乙醇溶液定溶到50 mL，混勻，20～30℃下反應15 min，418 nm處分光光度計檢測(15～180 min內穩定)。以70%乙醇溶液為空白對照。蘆丁標準品與樣品進行同樣的反應并繪制標準曲線，樣品黃酮含量由標準曲線換算而得，并以蘆丁當量表示。

1.3.3 DPPH法檢測粗提物的抗自由基活性

參照柳建軍等的方法［7］，并做適當修改。準確配制質量濃度為87.52 mg/L DPPH液(約2.22×10-4M)，置于冰箱中冷藏備用。取2 mL(濃度為2.22×10-4M)DPPH溶液與2 mL無水乙醇溶液混勻，測定其在517 nm波長處的吸光度(Ac)，設定此時自由基清除率為零。將濃度為 1、3、6、9、12 μg/mL的樣品液2 mL分別與2 mL DPPH液混合均勻，測定反應液在517 nm波長處的吸光值(As)。同時將濃度為 1、3、6、9、12 μg/mL 的樣品液 2 mL，分別加入2 mL的無水乙醇溶液后混合均勻，測定其在517 nm波長處的吸光度作為空白校正(Ao)。待測樣品需室溫避光反應30 min，然后測定其吸光值，Vc作為陽性對照。按下式計算自由基清除率(%):

清除率=(Ac-As)/Ac×100%

式中:Ac=2 mL DPPH溶液+2 mL無水乙醇的吸光度;

As=2 mL DPPH溶液+2 mL樣品液的吸光度。

1.3.4 SOS-Lux體系檢測粗提物的毒性及抗毒活性

細菌的SOS反應被廣泛用于檢測細菌應對環境因子變化如干燥、真空、抗生素、環境毒物等，本文通過檢測是否誘導細菌產生SOS反應來評價提取物的毒性，并通過檢測對細菌SOS反應的抑制效應來評價提取物的抗基因毒和抗細胞毒作用。Vibrio fischeri lux報告基因構建的SOS-Lux體系是最方便快捷和直觀的SOS反應檢測方法之一。recA基因是最主要的SOS反應基因，Sal94菌株是在Salmonella typhimurium細菌中導入pRecA::LuxCDABE tol-CCCmRAmpR質粒，通過檢測發光基因表達變化檢測細菌的 SOS反應強弱［11］。在抗生素選擇壓力下(100 μg/mL氨芐青霉素和 25 μg/mL 卡那霉素)，Sal94在LB液體培養基中26℃過夜震蕩培養，第二天用新鮮LB 1∶100稀釋，繼續培養到對數期。

1.3.4.1 SOS反應圈檢測樣品基因毒和抗基因毒直觀觀察

取100 μL上述對數期菌液均勻涂于LB固體平板上，無菌打孔器打孔，并將不同濃度的樣品和陽性誘導物絲裂霉素C(MMC)加入其中。繼續培養5～8 h，黑暗條件下單反相機長時間曝光，觀察樣品誘導SOS反應圈大小，同時觀察樣品對比鄰MMC誘導的SOS反應的抑制作用。

1.3.4.2 粗提物對MMC誘導的SOS反應的抑制作用

取上述對數期菌液1 mL，同時加入不同濃度的樣品液和終濃度1 μg/mL的MMC，作用50 min，離心收集菌液，加入新鮮LB培養基表達培養2.5～3 h。取1 mL表達菌液分別用發光儀和分光光度計測發光值和OD600的吸收值，計算相對發光強度RLUs/OD600。陰性對照不加樣品及MMC，陽性對照為只加MMC。誘導因子(induction factor，IF)的計算用被測樣品相對發光強度除以陰性對照的相對發光強度。

樣品對細菌SOS反應的抑制率%=(1-IF樣品/IF陽性) ×100

1.3.5 黃連木葉粗提物對細菌絲狀化的影響

許多細菌在面對不利環境時細胞會停止分裂，通過細胞形態發生變化來適應環境，如細胞絲狀化等。因此可以用細胞的形態變化來反應環境因子的細胞毒性或者抗細胞毒性。本文在對Sal94細胞進行SOS反應誘導和提取物抗基因毒實驗的同時，將陰性對照、陽性對照及提取物樣品處理組細菌離心，等滲溶液洗滌去雜質后涂片，高倍鏡下觀察細胞形態，CCD顯微拍照。對圖片用相關軟件進行菌體識別和相對長度統計，比較樣品濃度對細胞絲狀化的影響。

2 結果與討論

2.1 黃連木葉乙醇溶液粗提物得率和黃酮含量

史清文等用甲醇回流提取和乙醚萃取并過硅膠柱，分離得到了三種主要成分:槲皮素、沒食子酸乙酯、間雙沒食子酸乙酯，說明黃連木葉含有豐富的黃酮和單寧等［9］。柳建軍等以黃連木嫩葉為原料的提取浸膏的得率達到7.43%［7］。本研究對黃連木葉粗黃酮進行提取后，并對提取方法進行了初步的優化，選擇50%乙醇溶液和超聲輔助提取，粗提物的得率提高到6.05%(%w/w)。以蘆丁質量濃度(μg/mL)為橫坐標，吸光度為縱坐標，得回歸方程:Y=0.0305X+9E-5(R2=0.9996)。樣品中黃酮的含量以蘆丁的相對量(mg/g)測定為137.5±14.3 mg/g。

2.2 黃連木葉粗提物清除DPPH自由基效應

由表1可知，黃連木葉提取物清除DPPH自由基的清除率隨著濃度的加大逐步呈增加的趨勢，具有很好的劑量效應關系?？寡趸瘎PPH自由基的清除能力可以用IC50值表示，即達到DPPH清除率50%時抗氧化劑的質量濃度［12］。本實驗測定IC50值分別為黃連木葉粗提物5.65、Vc7.70 μg/mL，說明黃連木葉粗提物清除自由基的能力要強于Vc。柳建軍等對黃連木嫩葉提取物的抗自由基能力測定的結果表明，乙酸乙酯萃取物的活性最強，與Vc能力相當，前者與本文的結果基本吻合，后者與本文存在一定差異［7］。黃連木葉提取物抗DPPH自由基活性研究表明，黃連木葉粗提物具有相當強的抗氧化活性作用，已超過VC的抗氧化活性，我們的實驗數據為黃連木葉提取物在食品、醫藥、化工等領域的應用提供了有力的證據。

表1 粗提物和Vc清除DPPH自由基效應Table 1 DPPH free radical scavenging rates of crude extracts and Vc

3 32.26 6 54.76 9 76.47 12 86.71 1 10.3 3 21.78 Vc 6 39.44 7.7 9 58.28 12 76.63

2.3 黃連木粗提物的毒性及抗基因毒檢測

SOS-Lux體系被廣泛用于檢測細菌應對環境因子變化如干燥、真空、抗生素、毒物等。本文通過直觀的SOS反應圈大小和亮度直接檢測了一定濃度提取物樣品的致毒性和抗毒性，結果見圖1。反應圈1沒有明顯的熒光出現，表明黃連木粗提物在10 mg/mL范圍內沒有誘導細菌的SOS反應，反應圈2的強度較3減弱，說明提取物可以抑制MMC誘導的SOS反應。反應圈4與5、6與7、8與9、10與11的結果表明，擴散的提取物對比鄰的MMC誘導反應有明顯的抑制效果，表現為兩孔之間的交叉擴散區發光強度的明顯減弱。

通過發光儀和分光光度計檢測計算SOS反應的誘導因子(Induction Factor，IF)，可以量化環境因子對SOS反應的誘導效應和抑制效應。細菌的SOS反應通常是細菌受到環境不利因子作用時細胞DNA損傷等誘導的反應，因此誘導因子IF的大小可以代表環境因子的毒性大小。本文以MMC為陽性誘導物(IF=19.46)，而不同濃度的黃連木葉粗提物對MMC誘導的SOS反應有明顯的抑制效應，其IF與加入的樣品量成反比，抑制率與加入的樣品量成正比，見表2。與相同濃度的Vc比較，其效應明顯優于Vc。

圖1 粗提物對絲裂霉素C誘導的SOS反應的抑制Fig.1 The antigenotoxic detection of the crude extracts through SOS response induced by MMC

表2 粗提物抗絲裂霉素(MMC)誘導的細菌SOS反應Table 2 Inhibition effects of the crude extracts of on SOS response induced by MMC

2.5 7.47 61.63 5 6.46 66.85

2.4 黃連木葉粗提物對細菌絲狀化的影響

細菌絲狀化是細菌應對不利環境因子(如抗生素的作用等)的方式之一［13］。圖2是黃連木葉粗提物對細菌細胞形態變化的影響結果。圖2A是不同處理條件下細菌在高倍顯微鏡下的照片，結果顯示，陽性對照的菌體長度最長，陰性對照的菌體最短，而提取物處理組菌體長度介于兩者之間，且與濃度呈負相關。說明黃連木葉粗提物對MMC誘導的細菌絲狀化有明顯的抑制作用。圖2B是用圖像處理軟件對照片的菌體進行識別并進行相對長度統計，以不同相對長度段為橫坐標，以細菌所占百分比為縱坐標的結果(每組統計細菌數n＞200)。圖2C是每組平均相對長度的統計結果及顯著性分析的結果。從中可以看出，陰性對照的菌體相對長度大多小于20，30以上很少;而陽性對照組≥50的菌體在各組中最多，說明MMC對細菌絲狀化有明顯的誘導;黃連木提取物的作用使MMC的誘導作用減弱且與濃度正相關，說明其對MMC導致的細胞損傷有一定的抑制作用。平均相對長度的組間差異分析表明，所有MMC作用組均極顯著區別于陰性對照組(﹠﹠P＜0.01)，而低濃度提取物作用組(＜1 mg/mL)與陽性對照只有顯著性差異(*P＜0.05)，高濃度組(樣品濃度≥21 mg/mL)，與陽性對照只有極顯著性差異(＊＊P＜0.01)。

圖2 粗提物對細菌絲狀化的影響Fig.2 Effects of crude extracts on bacteria filament induced by MMC

3 結論

本文采用50%乙醇溶液和超聲輔助提取的條件對黃連木葉進行提取，黃酮粗提物的得率為6.05%，其黃酮含量為137.5±14.3(mg/g)蘆丁當量;DPPH自由基清除能力的數據表明黃連木葉粗提物清除自由基的能力要強于Vc;提取物在10 mg/mL濃度范圍內沒有誘導細菌的SOS反應，而對絲裂霉素C誘導的細菌SOS反應及細菌絲狀化有明顯抑制效果。

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