基于外翻腸囊模型大鼠吸收的中藥毛冬青三萜皂苷類成分電噴霧多級質譜快速分析研究

周中流，李建蘭，楊志麗

湛江師范學院化學科學與技術學院制藥工程系，湛江 524048

毛冬青(Ilex pubescens)為冬青科冬青屬植物毛冬青的干燥根，是我國南方常用的中藥材，具有清熱解毒、活血通脈、消腫止痛的功效，臨床上廣泛應用于治療冠心病、心絞痛、血栓閉塞性脈管炎、中心性視網膜炎和脈管炎等，有很好的療效［1］。文獻報道毛冬青根中的三萜皂苷類化合物具有降壓、降脂消肥、正性肌力作用、促進血腫吸收和抗炎等功效，為其主要的活性成分［2］。近年來，對毛冬青的研究主要集中在其中三萜皂苷的分離、純化和結構鑒定方面［3-5］(見表 1)。

在前期研究中［6］，筆者從毛冬青藥材中提取得到毛冬青總皂苷，初步藥理實驗結果表明毛冬青總皂苷提取物具有一定的抗血小板聚集活性。為了進一步闡明毛冬青總皂苷在體吸收的活性成分，本研究采用外翻腸囊法和電噴霧多級質譜進行毛冬青總皂苷提取物吸收的研究，旨在建立一種快速、簡便的中藥提取物吸收成分群發現和確認的新方法，為中藥毛冬青藥材的質量控制及以毛冬青為原料的新藥研發提供參考。

1 儀器、試劑與藥品

Finnigan LCQDECA電噴霧離子阱質譜儀(美國Thermo-Finnigan公司);SORVALL centrifuges ST-21高速冷凍離心機(美國Sorvall公司);KQ-100E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);恒溫浴槽、氧氣瓶(95%O2與5%CO2混合氣體)，100 mL培養皿、燒杯、吸管、量筒、手術板、手術器械、灌注設備。

毛冬青由桂林三金藥業股份有限公司提供，藥材經由廣西師范大學生命科學院唐紹清教授鑒定為為冬青科植物毛冬青Ilex pubescens的干燥根(產地廣西)。GibcoTMMedium 199培養基粉(含Earle’s鹽和 L-谷氨酰胺，不含碳酸氫鈉，Cat.No.31100-035，Lot No.1141059，Invitrogen Corp.，USA);NaHCO3，生理鹽水;其它化學試劑均為分析純。Wistar大鼠，雄性，體重(290±20)g，購自北京維通利華實驗動物有限公司。合格證號 SCXK(京)11-00-0006，以標準顆粒飼料飼養。

2 方法與結果

2.1 藥品的制備

參照前期研究的方法［6］，取毛冬青干燥根粉末600 g，在80℃下，以3000 mL 50%乙醇溶液提取3次，每次1 h，合并提取液，減壓濃縮得提取物34.8 g，加蒸餾水溶解，靜置過夜，過濾，將濾液稀釋后加到已經預處理好的D101大孔樹脂柱上，先用蒸餾水洗脫，然后用50%的乙醇水溶液進行洗脫，合并洗脫液并減壓濃縮至干(無醇味)，進一步冷凍干燥，即得毛冬青總皂苷凍干粉8.3 g。

2.2 M199培養液與含藥培養液的配制

稱取培養基粉9.5 g，配制成1L培養液(其中加入2.2 g NaHCO3)。稱取毛冬青總皂苷6.0 g，溶于100mL M199培養液中(0.6 mg/mL)得到毛冬青總皂苷培養液。

2.3 模型的制備與取樣［7-9］

實驗前禁食12 h，自由飲水。實驗時用水合氯醛麻醉。麻醉后將動物固定于手術板上，腹部朝上。于劍突下腹正中線切開，先找出胃，從幽門下取出十二指腸、空腸或回腸，大約20 cm。將取出的小腸立即置于手術盤中用生理鹽水沖洗，洗凈內容物。用一根直徑適宜于實驗動物腸段的玻璃棒。一端為光滑而稍突起。將玻璃棒對著腸段口端方向輕輕插入，直至腸段的肛門端剛剛蓋住塑料管的圓口，用絲線扎緊。再用鑷子夾住腸段口端的斷緣，將腸段翻轉，輕輕向下拉動，待整個腸段外翻后，把另一切口扎緊。用50 mL玻璃注射器從腸的一端注入15 mL M199培養液，結扎。立即將整段小腸放入持續通以氧氣的37℃含藥培養液中。從小腸囊放入三角瓶中開始計時，在37℃恒溫水浴中培養60 min。取出小腸囊，用紗布吸凈粘膜側藥液，以免污染囊內溶液。剪開一端，倒出囊內溶液。所得樣品立即放入-40℃冰箱冷凍保存。

2.4 質譜分析條件

從-40℃冰箱中取出腸液，室溫下融化，搖勻。過濾后直接進行電噴霧正、負離子掃描分析。掃描范圍:m/z 50～2000;離子源噴射電壓5 kV;毛細管溫度250℃;毛細管電壓±5 V;殼氣(N2)流速20 L/min;離子阱壓力3.2×107Pa;注射泵進樣速度1.5 μL/min;多級串聯質譜(ESI-MSn)碰撞能量為40%。

表1 毛冬青中主要三萜皂苷類化合物Table 1 Chemical structures of the major saponins from I．pubescens

注:*glc代表葡萄糖;xyl代表木糖;rha代表鼠李糖;glu A代表葡萄糖醛酸;arab代表阿拉伯糖Note:glc=glucopyranosyl;xyl=xylopyranosyl;rha=rhamnopyranosyl;glu=glucuronic acid;arab=arabopyranosyl

2.5 結果分析

圖1 樣品在正離子模式下的電噴霧一級質譜圖Fig.1 ESI-MS spectrum of the sample in positive ion mode

圖1和圖2分別為腸吸收液在正、負離子模式下的電噴霧一級質譜圖。在正離子ESI-MS譜中出現各皂苷成分的［M+Na］+準分子離子峰，負離子ESI-MS譜中則為［M-H］-準分子離子峰。通過正、負離子質譜的綜合推斷，確定腸吸收液中皂苷的分子量分別為1074、928、912、766、664 和652。為了對檢測到的各皂苷成分進行確認，對各準分子碎片離子進行二級或三級質譜分析。從表1不難看出，毛冬青中三萜皂苷按其糖鏈結構主要分為C-3單糖鏈皂苷和C-3，28雙糖鏈皂苷。單糖鏈皂苷的二級質譜中主要給出C-3位糖鏈依次脫去單糖基的碎片離子，而雙糖鏈皂苷則優先在C-28位發生各單糖基的順序斷裂，脫去整個C-28位糖鏈后形成的離子峰為基峰，以之為母離子繼續進行多級質譜實驗則出現C-3位糖鏈的斷裂［10］。表2給出了本研究檢測到的各皂苷成分在負離子模式下的多級質譜中主要碎片離子的質量數。

圖3是m/z 1073(［M-H］-)的準分子離子的二級質譜，譜中給出了一個基峰為m/z 911的碎片離子，同時還給出了m/z 779、617和471等逐個脫去糖基的碎片離子。在負離子模式二級質譜中，當毛冬青中雙糖鏈皂苷的C-28位糖鏈較短時，C-28位糖鏈上的糖基優先順序被裂解，整個C-28位糖鏈被脫去后的離子峰為基峰，檢測不到整個C-28位糖鏈的碎片離子。通過分析圖1和圖2，確定m/z 911碎片離子代表苷元和3位糖鏈，同時提示C-28糖鏈應該是由1個六碳糖連接而成。

圖4 m/z 911準分子離子的三級質譜圖Fig.4 MS3spectrum of ion at m/z 911

離子m/z 911的三級質譜(圖4)給出了m/z 779、617和471的碎片離子，提示3位糖鏈末端為一個六碳糖，與苷元C-3位直接相連的為一個五碳糖，糖鏈中間是一個六碳糖。根據上述多級質譜數據并結合文獻報道，確定分子量為1074的皂苷為ilexoside O(5)。按照同樣的方法，分子量為928、912、664和652的三萜皂苷依次歸屬為:ilexoside K(4)、ilexoside J(3)、ilexoside E(8)和 pedunculoside(13)。從毛冬青中分離得到分子量為766的皂苷有3個，分別為 ilexoside A(1)、ilexoside D(2)和Ziyu-glycosideI(12)，均含有兩個糖基。從結構上分析，這三個皂苷的質譜裂解途徑和所得產物的質荷比(m/z)均相同，在電噴霧質譜中很難一一區分。因此，可以推測大鼠腸吸收液中至少含有上述3個皂苷之一。

3 討論

中藥及其復方給藥方式多為口服，中藥成分經消化道、腸道菌群等的作用后，有的直接排泄，有的被選擇性吸收，再經肝藥酶作用，最終進入血液發揮藥效［9］。由于中藥成分復雜，血藥濃度一般較低，檢測有一定難度，因此本研究嘗試采用外翻腸囊模型模擬毛冬青總皂苷在小腸的吸收，通過對腸吸收液進行電噴霧多級質譜分析，初步明確毛冬青總皂苷可被吸收入腸成分的結構和類型，為進一步闡明毛冬青總皂苷可被吸收入血的主要活性物質奠定基礎。

表2 腸吸收液中皂苷的多級質譜數據Table 2 Multiple-stage mass spectra of saponins from the intestinal absorption fluids

外翻腸囊模型由Wilson和Wisman于1954年創建。該模型的優點是，操作簡單、快捷、成本低、重復性好［8，9］。不足之處在于腸管缺乏血液循環和神經控制，體外時間過長后腸黏膜功能形態容易發生變化。在實驗過程中需不斷小量通入95%O2～5%CO2，以保持腸管在實驗期間腸黏膜的活性。

電噴霧多級質譜因為其具有靈敏度高、分析速度快和消耗樣品少等優點，適于分析皂苷結構［10］。電噴霧質譜不僅可以直接用于確定混合皂苷中各單體皂苷的分子量，還可以通過多級質譜確定已知甚至未知的單體皂苷的化學結構。毛冬青三萜皂苷在紫外區主要為末端吸收，采用色譜技術對檢測器要求較高且成本高。本實驗腸液樣品中非皂苷類成分對微量皂苷成分的可能干擾，需要進一步研究。

本研究利用全掃描電噴霧質譜對毛冬青總皂苷腸吸收液進行快速分析。通過多級質譜得到一系列皂苷的苷元和糖鏈的結構信息，結合文獻報道，確認了其中5個已知的皂苷成分。同時，其腸吸收液中至少含有 ilexoside A(1)、ilexoside D(2)和 ZiyuglycosideⅠ(12)中某一個三萜皂苷。毛冬青總皂苷腸吸收液中非皂苷類成分需要進一步研究。本方法與HPLC-ESI-MS-MS技術相比，具有操作簡單、成本低、效率高等優點。

1 Yin WQ(尹文清)，Zhou ZL(周中流)，Zou JM(鄒節明)，et al.Nuclear magnetic resonance spectroscopic characterization of the sugar chain of Ilexoside O and Infrared Spectroscopic analyzation of degradation of the sugar chain.Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發)，2008，20:212-216.

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6 Yin WQ(尹文清)，Zhou ZL(周中流)，Zou JM(鄒節明)，et al.Extraction，purification and characterization of total lignans from Ilex pubescens.J Chin Med Mater(中藥材)，2007，30:1153-1155.

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