正交試驗法優選復方四參顆粒劑的提取工藝

陳文娟，胡道德

上海交通大學附屬第一人民醫院，上海市 200080

復方四參顆粒劑由太子參、丹參、南沙參、苦參等9味中藥組成，具有益氣養陰、清熱活血、養心安神之效。臨床上主要應用于病毒性心肌炎。中醫學上認為病毒性心肌炎為虛實相兼之證，虛以氣陰兩虛為主，實以瘀熱交阻常見。復方四參顆粒劑的臨床療效顯著，對癥狀的改善尤為明顯;同時，對病毒性心肌炎后心律失常的控制也有較好的療效。病毒性心肌炎所致的各類心律失常是臨床治療的重點和難點?？剐穆墒СＮ魉幘哂酗@著的電生理特性，但作用單一，并不完全符合病毒性心肌炎的病理生理特點，部分患者療效欠佳，而且有嚴重的副作用，如抑制心臟正常生理功能、誘發更嚴重的心律失常等。復方四參顆粒劑治療病毒性心肌炎在我院取得了很好的療效［1］。

丹酚酸B是丹參中抗病毒性心肌炎的活性成分，也是復方四參顆粒劑中的主要成分。為了提高丹酚酸B的得率，我們用正交實驗法對影響丹酚酸B的提取條件如提取次數、煎煮時間、加水量等進行研究，優選最佳提取工藝，為實際生產提供理論依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀(美國安捷倫公司);AL104電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司);R-205旋轉蒸發器(上海申勝生物技術有限公司);SHB-ⅢA循環水式多用真空泵(上海豫康科技儀器設備有限公司);W2010數控恒溫浴鍋(上海申勝生物技術有限公司);DW調熱電熱器(上海平環燃燒設備工程技術有限公司)。

1.2 試劑

甲醇為色譜純;磷酸為分析純;水為超純水;太子參、丹參、南沙參、苦參等藥材購于上海萬仕城國藥制品有限公司;丹酚酸B對照品購于中國藥品生物制品檢驗所，供含量測定用(批號111562-201110)。

2 方法與結果

2.1 正交實驗設計

選擇藥材加水量(A)、煎煮次數(B)、煎煮時間(C)作為考察因素。本實驗采用L9(34)正交表安排實驗。以丹酚酸B含量和干膏得率為指標對復方四參顆粒劑的提取工藝進行優選。因素水平表見表1。

2.2 樣品提取液的制備

按正交表的實驗安排，依處方比例稱取各味藥材，加水浸泡過夜，煎煮、合并提取液，離心取上清液，上清液濃縮成流浸膏，調整流浸膏的密度在1.15～1.2之間，得樣品提取液。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal design

2.3 丹酚酸B含量測定方法的建立

2.3.1 色譜條件［2］

色譜柱:C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動相:甲醇-0.1%磷酸溶液;檢測波長:286 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫:25℃;理論板數:61367;進樣體積:10 μL。

2.3.2 供試品溶液制備

取提取濃縮液0.1 mL，加75%甲醇0.9 mL，混勻，離心，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液作為供試品溶液。

2.3.3 對照品溶液的制備

精密稱取丹酚酸B對照品0.4587 mg至25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得0.018 mg/L丹酚酸B對照品儲備液。

2.3.4 陰性對照溶液制備

按處方比例稱取除丹參外的其他藥材，按照與供試品相同的方法制備陰性對照液。

2.3.5 標準曲線繪制

精密吸取對照品溶液 5、10、15、20、30 μL 進樣，記錄峰面積，以丹酚酸B面積對進樣量線性回歸?；貧w方程為 A=7139．6C-28．398(R2=1.0000)，結果表明，丹酚酸B在0.92～5.4 μg線性良好。

2.4 干膏得率的測定［3］

精密吸取提取液7 mL，置已干燥至恒重的蒸發皿中，水浴蒸干后，于105℃干燥3 h至恒重，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質量，計算干膏得率。

2.5 丹酚酸B含量測定

分別吸取供試品溶液和陰性對照品溶液按上述色譜條件進樣，測定峰面積，代入標準曲線，計算丹酚酸B的含量。供試品及陰性對照溶液色譜圖見圖1。正交實驗結果見表2。方差分析見表3、4。

2.6 最佳提取工藝的確定

表2中，直觀分析和效應曲線圖結果表明，以干膏得率為指標，方差分析結果見表3，各影響大小為C＞B＞A，即提取時間＞提取次數＞加水量，最佳提取工藝為A3B1C3，次優工藝為A2B2C3;以丹酚酸B含量為指標，方差分析結果見表4，各影響大小為B＞A＞C，最佳提取工藝為 A3B2C1，次優工藝為A2B2C3。由此得出最優工藝為A2B2C3。丹酚酸B對熱不穩定，隨著煎煮時間的增加，丹酚酸B含量減少，綜合以上分析以及節能考慮，確定復方四參顆粒劑的水提工藝8倍量水，提取2次，第一次時間為2 h，第二次時間為1 h。

圖1 對照品和復方四參顆粒劑的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatogram of reference substances and Fufang Sishen granular formulation

表2 正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal test

表3 干膏得率方差分析Table 3 Results of analysis of variance of dry extract

F0.05(2，2)=19，F0.01(2，2)=99

表4 丹酚酸B含量方差分析Table 4 Results of analysis of variance of salvianolic acid B

2.7 最佳工藝的驗證

平行稱取3份處方藥材，按照最佳工藝提取并制備相應的樣品，測定干膏得率、丹酚酸B含量。結果表明，其平均干膏得率為16.58%，丹酚酸B的平均含量為22.42 mg。驗證結果與正交實驗結果基本一致，表明該工藝穩定、可行。

3 討論

復方四參顆粒劑是醫院制劑，在長期的臨床實踐中證明其療效顯著，但是一直沒有具體的質量標準。太子參為本方君藥，但其所含化學成分無含量測定對照品，無法對其進行質量控制。選用丹參中的丹酚酸B為含量測定指標成分，其含量測定方法成熟、可靠，可以為復方四參顆粒制劑的質量控制標準提供參考。

根據文獻［4，5］和預試驗，影響復方提取工藝效果的主要因素是溶劑用量、煎煮次數和煎煮時間等。對溶劑的選擇是依據藥材中有效成分都溶于水的性質和臨床使用方式多為水煎服的特點。采用水煎煮法提取，通過正交設計綜合考慮各因素，結果經直觀分析表明:最佳水提取工藝為加8倍量的水，提取2次，每次2 h，但是丹酚酸B為熱不穩定成分，故煎煮時間增加，其含量會有所下降，故改為第一次2 h，第二次1h。經驗證試驗，結果與正交試驗相一致，表明該工藝穩定、可行。

丹酚酸B具有很強的抗氧化作用，能清除氧自由基［6］、抑制脂質過氧化反應，對心臟具有較好的保護作用，但是丹酚酸B對熱不穩定，長時間暴露在空氣中，含量會有所降低。為保證有效成分的提取率，在對提取液的濃縮過程中，需要采用減壓濃縮。

1 Wei QH(魏強華)，Shi YY(石蘊玉)，Shen BS(沈博生)，et al.Clinical study on Fufang Sishen decoction in treating arrhythmia after virus myocarditis.J Chin Integr Med(中西醫結合學報)，2004，2:97-99.

2 Yao HJ(姚慧娟)，Hu DD(胡道德)，Jin J(金劍)，et al.Determination of verbascoside and salvianolic acid B in Linqihuangban granules by HPLC gradient elution method.Chin J New Drugs Clin Rem(中國新藥與臨床雜志)，2010，29:123-126.

3 Ji QY(季巧遇)，Li YG(李詒光)，Liu XH(劉旭海)，et al．Optimization of extraction technology of Jianwei Xiaoshi orally disintegrating tablet by orthogonal test.Chin J Exp Tradit Med Form(中國實驗方劑學雜志)，2011，17:512-15.

4 Du ZL(杜中良)，Cheng ZT(程振田).Optimization of the extraction technology of salvianolic acid B from salvia miltiorrhiza by orthogonal experiment.China Pharm(中國藥房)，2010，21:2911-2912.

5 Li SL(李紹林)，Zhang JJ(張建軍).Optimization of extracting technology of Salviae miltiorrhizae.Chin J Exp Tradit Med Form(中國實驗方劑學雜志)，2011，17:45-47.

6 Wang SP(王舒平)，Wang YY(王艷艷)，Yin CN(尹彩娜)，et al.Effect of salvianolic acid B on digestive system ROS level in high sugar dietary mice.Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發)，2009，21:948-951.