精子DNA碎片對IVF-ET結局的影響

張 帥，孟嘯寅，卓勝楠，崔志英，崔險峰，張云山

（1.天津醫科大學研究生院，天津 300070；2.天津市中心婦產科醫院生殖醫學中心，天津 300100）

近年來，不育癥的發病率在世界范圍內呈逐年上升趨勢。我國目前的患病率約為10%～15%，其中50%是由男方因素引起的。精液常規分析是尋找男性不育原因的第一步檢查，主要包括精子密度、精子數量、前向運動力和精子形態學檢查等，然而這些檢查只反映睪丸的生精功能，不能反映精子DNA損傷和斷裂的情況。因此，上述檢查指標不能作為評估男性生育力的唯一指標，況且約有15%的男性不育患者精液檢查是正常的[1]。由此看來，精液常規分析已經不能作為評估男性生育力的最佳指標，而有必要探討新的男性不育評價指標?，F在隨著輔助生殖技術（assisted reproductive techniques,ART）實驗室檢測技術的進步發展，對精子DNA 損傷和碎片化檢測分析成為近幾年的研究熱點，可以說，它不僅作為一種對傳統精液常規檢測的補充，而且有利于臨床醫生對男性生育能力評估工作的進一步完善。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

1.1.1 研究對象 2012年3月-7月就診于天津市中心婦產科醫院生殖醫學中心符合納入標準的139例體外受精-胚胎移植助孕初篩患者。納入標準：常規體外受精（IVF），新鮮精液標本，夫婦染色體G 顯帶技術檢查均為正常核型，男性檢查包括男性第二性征、陰莖、陰囊、精索、輸精管、附睪、睪丸等均無異常。排除標準：重度少弱精子癥患者。由于6例因各種臨床因素取消移植，共計133例進入胚胎移植（ET）周期，平均年齡（30.1±3.9）歲，平均不育年限（5.1±2.8）年。

1.1.2 儀器和試劑 計算機輔助精子分析儀為北京清華同方（CASAS-QH-Ⅲ）產品；精子DNA 碎片檢測試劑盒為深圳博銳德生物科技有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 精液優化分離及精液常規分析 精液標本采集時間：IVF 取卵日前最后一次排精，禁欲2～7 d，手淫法收集新鮮精液于取精杯內，立即放于37℃恒溫箱內，完全液化后充分混勻；上泳法處理精液用人輸卵管液（HTF）按照WHO 標準配制[2]，將制備后精液均分為兩份，一份按照WHO 標準行精液常規分析；采用蘇木素-伊紅染色；按照Kruger（1999）評分標準行精子形態學分析；另一份用配制HTF 調精子濃度[（5～10）×106/mL]用于精子DNA 碎片檢測，并根據DFI 值將上述患者分為A組（DFI＜17.6%）、B組（17.6%≤DFI≤30%）、C組（DFI＞30%）。

1.2.2 精子染色質擴散實驗（1）制片：①易熔凝膠管于80℃孵育20 min，融化后置于37℃待用（平衡5 min）；②生理鹽水調精子濃度（5～10）×106/mL；取稀釋后標本60μL，加入熔化易熔凝膠管（37℃保溫），混勻，37℃孵育待用；③制備精子懸液30μL加入載玻片包被區，蓋上蓋玻片，置2～8℃冰箱5 min；④小心移去蓋玻片；⑤載玻片垂直浸入反應液M（0.09%的H2O2醋酸溶液）反應池內，20～28℃反應7 min；⑥將載玻片浸入反應液N（0.5% SDSTris-HCl 緩沖液）反應池內，20～28℃反應25 min；⑦載玻片水平浸入大量純化水中5 min；⑧將載玻片依次浸入70%、90%、100%乙醇反應池，2 min；⑨自然干燥。（2）染色：載玻片以瑞氏染液（0.2%瑞氏色素、0.06%吉氏色素甲醇溶液）15～20 滴覆蓋，片刻再加入瑞氏緩沖液（pH 值6.4～ 6.8，0.06 mol/L磷酸鹽緩沖液）30～40 滴，以洗耳球吹打混合染液，室溫15 min 后流水沖洗染片；自然干燥。（3）結果判斷：在普通光學顯微鏡下計數500個精子，根據Fernández 標準分級：a.大光暈，暈輪≥精子頭橫徑；b.中光暈：介于大小光暈之間；c.小光暈：暈輪≤精子頭橫徑1/3；d.無光暈；e.退化精子。大光暈、中光暈精子為DNA 完整精子，小光暈、無光暈和退化精子為DNA 損傷精子。

1.2.3 控制性超促排卵及IVF-ET（體外受精-胚胎移植）按常規GnRH-a 長方案進行，即從前一月經周期第21 日起皮下注射GnRH-a 行降調節，達降調節標準后，同時加用促性腺激素（Gn）誘導卵泡發育，當3個主導卵泡直徑≥18 mm 時，停用GnRH-a 和Gn，根據患者具體情況當晚肌注HCG 4 000～10 000 IU 不等，36 h 后在陰道B 超引導下行穿刺取卵術。取卵當日采用常規IVF 方法授精，授精后16～18 h 觀察受精情況。授精42 h 和72 h 觀察卵裂情況。見2個原核（PN）和第2 極體（Pb2）為正常受精，見≥3個PN 或≤1個PN為異常受精。根據改良的Dale 方法對胚胎進行評級，將胚胎分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級，Ⅰ～Ⅲ級胚胎為可移植胚胎，Ⅳ級胚胎為不可移植胚胎。采卵后72 h 移植1～3個胚胎，黃體支持采用黃體酮60 mg/d 肌肉注射，剩余有發育潛能的胚胎行冷凍保存。

1.2.4 觀察指標計算 精子DFI=[（小光暈精子+無光暈精子+退化精子）/500]×100%；IVF 受精率=受精胚胎數/獲卵數×100%；卵裂率=2PN 卵裂數/IVF受精數×100%；優質胚胎率=優質胚胎數/2PN 卵裂數×100%；ET 后14 d 測定血清β-hcG≥25 mIU/mL確定為生化妊娠，28 d 后B 超檢查宮腔內見妊娠囊確定為臨床妊娠。

1.3 統計學方法 采用SPSS11.5 統計軟件進行數據分析，計量數據符合近似正態分布者以±s 表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，組間兩組比較采用LSD-t 檢驗；偏態分布者以M（P25，P75）表示，組間比較采用Wilcoxon 秩和檢驗；生化妊娠數、臨床妊娠數的比較采用四格表χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3 組患者一般資料和部分精液常規參數比較 共計133例患者進入ET周期，其中A組33例，B組66例，C組34例。與A組比較,B組和C組正常形態精子率、精子前向活動力[（a+b）%]均降低，A、C組間差異有統計學意義（P<0.05），A、B組間差異無統計學意義（P>0.05）；與B組比較，C組正常形態精子率、精子前向活動力[（a+b）%]降低，差異有統計學意義（P<0.05）。3組患者的不育時間、禁欲天數、精液體積、精子濃度、圓形細胞數等差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

表1 A、B、C 3組一般資料及部分精液常規參數的比較（±s）Tab 1 Comparison of basic data and partial of conventional semen parameters in group A,B,and C（±s）

表1 A、B、C 3組一般資料及部分精液常規參數的比較（±s）Tab 1 Comparison of basic data and partial of conventional semen parameters in group A,B,and C（±s）

與A組相比*P<0.05；與B組相比#P<0.05

2.2 3 組患者IVF 受精結局的比較 與A組比較，B組和C組受精率均降低，差異有統計學意義（P<0.05）；與B組比較，C組受精率降低，差異有統計學意義（P<0.05）；與A組比較，B組和C組卵裂率、優質胚胎率降低，A、C組間差異有統計學意義（P<0.05），A、B組間差異無統計學意義（P>0.05）；與B組比較，C組卵裂率、優質胚胎率降低，差異有統計學意義（P<0.05）；A、B、C 3組間生化妊娠率、臨床妊娠率差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。

表2 A、B、C 3組受精率、卵裂率、優質胚胎率、生化妊娠率、臨床妊娠率的比較（±s,%）Tab 2 Comparison of fertilization rate,cleavage rate,high quality embryos rate,biochemical pregnancy rate and clinical pregnancy rate in group A,B,and C（±s,%）

表2 A、B、C 3組受精率、卵裂率、優質胚胎率、生化妊娠率、臨床妊娠率的比較（±s,%）Tab 2 Comparison of fertilization rate,cleavage rate,high quality embryos rate,biochemical pregnancy rate and clinical pregnancy rate in group A,B,and C（±s,%）

與A組相比*P<0.05；與B組相比#P<0.05

3 討論

目前對于精子DNA 碎片化是否影響受精率、胚胎發育及臨床妊娠率等尚存爭議[3]。Jiang 等[4]采用吖啶橙染色法（acridine orange staining technique,AOT）對116例接受IVF 男性精子進行DFI 檢測，并根據DFI 值分為DFI≤30%組和DFI＞30%組，結果顯示兩組之間受精率、卵裂率并無明顯差別。而Bungum 等[5]報道指出男性精子DFI 如果在30%以上，其獲得正常妊娠的可能性將會顯著降低。上述研究人員得出不同結論的原因可能是他們大都是對精漿原液（包括形態正常、異常精子和凋亡精子、圓形細胞等）行DFI 檢測分析，并非對形態正常精子進行DFI 檢測，如果對精液先行上泳法處理，再行DFI 檢測，其檢測結果則與真實DFI 水平更為接近[6]。而在2011年，Dugum 等[7]在發表于美國Journal of Andrology 的一篇綜述中指出，SCD 是一種新的精子DFI 檢測方法，它不僅特異度較高，而且具有操作簡單、耗時短等優點，所以易于在臨床上開展應用。本研究中，筆者采用SCD 法對139例接受IVF 的男性精子進行DFI 檢測，133例進入ET周期（因各種臨床因素取消移植6例），并根據Avenda?o和Jiang 等DFI 分組標準分為A（DFI<17.6%）、B（17.6≤DFI≤30%）、C（DFI>30%）3組，通過研究各組受精率、卵裂率、優胚率和妊娠結局的差異，評價精子DFI 檢測對IVF-ET 結局的影響。

本研究顯示，隨著DFI 的升高，A、B、C 3組精子前向活動力和正常形態精子率依次降低，且C組與A、B 兩組間差異均有統計學意義。這與Abad 等[8]研究結論相一致，即他們認為弱畸形精子癥患者精液中通常具有較高水平的活性氧類物質（reactive oxygen species,ROS），之所以精子DFI 與精子活力、形態表現出負相關性，可能與兩者均是精液ROS 的潛在氧化攻擊對象有關，即精液中ROS 達到一定濃度時，可同時引起精子DNA 和膜脂質結構的破壞。另外，國內萬艷等研究認為，還可能與精子DNA 損傷導致編碼Na+-K+-ATP 酶的基因發生改變、ATP酶變性，水解反應釋放能量障礙有關。同時，Makhlouf 等[9]認為，精子細胞核內DFI 的含量經歷一個由少到多的過程，即DFI 含量較少時，精子DNA 損傷斷裂的區域主要為非蛋白編碼區，此時并不會引起精子功能的明顯下降，如果精子DNA 損傷的斷鏈不能被及時修復，精漿中有害因素（如ROS）就會進一步導致精子DNA 的蛋白編碼區基因受到破壞，從而導致不同程度的精子功能缺陷。Bj觟rndahl 等[10]認為，精子染色質中DFI 會導致其結構穩定性的顯著降低，并可能引起IVF 受精過程中雄性原核形成受阻而導致IVF 受精率降低。另外，Kato 等[11]認為如果精子表達微管的基因受損時則會導致受精卵卵裂停滯、卵裂率降低，甚至會使胚胎碎片數量增多而影響胚胎質量。本研究顯示，隨著DFI值的升高，A、B、C 3組IVF 受精率、卵裂率、優質胚胎率呈逐漸下降趨勢，且C組與A、B 兩組間的差別均有統計學意義。這與Avenda?o 等研究結論相一致，即精子DFI 與其受精能力、胚胎卵裂率、優質胚胎率之間呈負相關性。

另一方面，本研究并未得出與Avenda?o 等完全一致的結論，即未顯示A，B，C 3組間生化妊娠率、臨床妊娠率的差異有統計學意義，這可能與本研究樣本例數不夠大有關。其次也可能與DFI 對精子受精能力、胚胎分裂功能的影響要遠大于受精后胚胎植入及妊娠結局的后續影響等有關。應該注意的是，胚胎植入母體子宮內膜后能否正常生長發育取決于諸多因素，例如，母-胎之間的免疫耐受狀態、血液營養供應、環境暴露、母體情緒應激變化等，所以筆者的研究結果沒有顯示出精子DFI 與生化妊娠率、臨床妊娠率的相關性。

綜上所述，筆者的研究顯示，精子DFI 影響精子活力和IVF 結局，尤其當DFI＞30%時會導致IVF受精率、卵裂率和優質胚胎率顯著降低。因此，對精液常規檢查正常的男性不育患者進行精子DFI 檢測對指導男性不育的治療有一定的臨床意義。

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［6］Avenda?o C,Oehninger S.DNA fragmentation in morphologically normal spermatozoa:how much should we be concerned in the ICSI era[J].J Androl,2011,32（4）:356

［7］Dugum M,Sandlow J I,Brannigan R E.Sperm DNA damage evaluation techniques[J].J Androl,2011,32（3）:207

［8］Abad C,Amengual M J,Gosálvez J,et al .Effects of oral antioxidant treatmentupon the dynamics of human sperm DNA fragmentation and subpopulations of sperm with highly degraded DNA[J].Andrologia,2012,[Epub ahead of print]

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［10］Bj觟rndahl L,Kvist U.Human sperm chromatin stabilization:a proposed model including zinc bridges[J].Mol Hum Reprod,2010,16（1）:23

［11］Kato Y,Rideout WM 3rd,Hilton K,et al.Developmental potential of mouse primordial germ cells[J].Development,1999,126（9）:1823