蒺藜內生真菌抗氧化活性菌株的篩選

劉雅莉，黃一泓，武文斌，張 雯

華東師范大學生命科學學院，上海200241

隨著基礎醫學和生命科學的不斷發展，人們對自由基的研究越來越多。自由基作為機體的正常代謝產物，在平衡狀態下，其在抗菌、消炎和抑制腫瘤等方面具有重要作用和意義;一旦平衡被打破，如機體受到疾病或某些外源性藥物和毒物的侵害，自由基便會產生強大的傷害作用，造成組織細胞損傷，進而引起機體疾病，甚至死亡［1］。目前，國內外研究發現自由基與糖尿病、高脂血癥、腫瘤、衰老、心腦血管疾病、炎癥等多種人體疾病的發生密切相關［2］。因此，尋找天然高效的抗氧化劑也越來越引起人們的重視。

植物內生真菌(Endophytic fungus)是指整個生活史或生活史的某個階段生活在健康植物組織內部，并不引起宿主植物出現明顯病害癥狀的真菌［3］。近年來，國內外已陸續報道了從多種植物中分離獲得了具有較好抗氧化活性的內生真菌。侯奎等［4］采用二苯代苦味肼基自由基(DPPH)酶標儀法對葛根的128 株內生真菌清除自由基的活性進行檢測，發現其中多株內生真菌都具有不同程度的抗氧化活性;另外Huang 等［5］研究了從29 株傳統中草藥分離到的內生真菌的抗氧化活性，并發現其抗氧化能力和發酵液中的多酚含量呈很好的相關性。蒺藜(Tribulus terrestris L.)，系蒺藜科蒺藜屬的一年生草本植物，在我國民間有非常悠久的藥用歷史，但目前有關蒺藜內生真菌的抗氧化活性的研究尚未見報道。本實驗對21 株蒺藜內生真菌的抗氧化活性進行了初步探索和篩選，以期為尋找新的天然抗氧化活性物質提供一條新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料

供試用的21 株蒺藜內生真菌均由本實驗室武文斌博士從山東泰山地區采摘的新鮮蒺藜莖部分離得到，經純化后現保存于華東師范大學資源植物化學實驗室。菌種編號、Gen-bank 序列號、所在屬及近似種見表1。

表1 蒺藜內生真菌Table 1 Endophytic fungus from Tribulus terrestris L.

1.1.2 培養基

馬鈴薯葡萄糖固體培養基(PDA)，查氏培養基，馬鈴薯葡萄糖液體培養基(PDB)。

1.1.3 試劑與儀器

試劑:二苯代苦味肼基自由基(DPPH)，Sigma產品;鄰苯三酚(pyrogallol)，Sigma 產品;其它所用試劑均為分析純。

儀器:恒溫振蕩培養箱、真空旋轉蒸發儀、循環水式真空泵、真空干燥箱、微型旋渦混合儀、超凈工作臺、電熱恒溫培養箱、恒溫水浴鍋、酶標儀、壓力蒸汽滅菌鍋、pH 計、電子天平。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化

將4 ℃冰箱保藏的21 株蒺藜內生真菌菌株分別接種于PDA 和察氏培養基上，置于28 ℃恒溫培養箱中培養3 d。

1.2.2 菌株的液體培養

分別將300 mL 馬鈴薯培養基和察氏液體培養基裝于500 mL 三角瓶中，滅菌后，接入活化的各供試菌株，置于搖床上，25～28 ℃、100 rpm 振蕩培養7 d。

1.2.3 發酵產物樣液的制備

各濃縮液的制備:各菌株液體培養結束后，雙層濾紙抽濾得發酵液，在50～60 ℃，70～80 rpm 的條件下，減壓濃縮至十分之一體積，加入3 倍體積的無水乙醇除糖兩次，5000 rpm 離心10 min，收集上清液，再濃縮至1/5 體積，于4 ℃冰箱中保存，備用。

JL13、JL14 和JL17 乙酸乙酯萃取物制備:在JL13 的發酵濃縮物中按1∶2 的體積比例加入乙酸乙酯萃取兩次，每次12 h(過夜)，收集乙酸乙酯萃取液后，在40 ℃，70～80 rpm 的條件下減壓濃縮，置于真空干燥箱中干燥，于4 ℃冰箱中保存，備用。

1.2.4 蒺藜內生真菌發酵產物抗氧化活性的測定

1.2.4.1 總抗化能力的測定

總抗氧化能力試劑盒(南京建成生物工程有限公司)。

1.2.4.2 對DPPH·自由基的清除能力［6］

參考譚君的方法稍作修改。DPPH·自由基用無水乙醇配制成0.65 mmol/L 的溶液，臨用時稀釋十倍，DPPH·自由基溶液的濃度在0.01 mmol/L～0.08 mmol/L 范圍內與其在517 nm 處的吸光度線性相關，其線性回歸方程為:A =0.1337 C DPPH·-0.0091，r2=0.9981。

在1.9 mL 0.065 mmol/L 的DPPH·自由基溶液中加入0.1 mL 不同菌株的樣液，于37 ℃反應30 min，5000 rpm 離心5 min，在517 nm 下測定吸光度Ai，以相應溶劑代替樣品作為空白對照，吸光度為Amax，相應樣品溶液的吸光度A0，3 次重復取平均值。DPPH·自由基的清除活性按下式計算:

DPPH· Scavenging(%)=［1－(Ai－A0)/Amax］×100%，半清除率濃度(EC50)由IC50計算軟件計算所得。

1.2.4.3 對OH·自由基的清除能力［7］

按照Smirnoff(1989)的方法(有改動)。在10 mL 試管中依次加入6 mmol/L 的硫酸亞鐵1 mL，6 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液1 mL 后，把不同菌株的樣液1 mL 分別加入試管中，然后加入0.1%的H2O2溶液1 mL，總體積5 mL，以雙蒸水補足體積，搖勻后在37 ℃水中溫育30 min，在510 nm 處測定吸光度值Ai，以相應溶劑代替樣品作為空白對照，吸光度為Amax，相應樣品溶液的吸光度A0，3 次重復取平均值。OH·自由基的清除活性按下式計算:

OH· Scavenging(%)=［1－(Ai－A0)/Amax］×100%，半清除率濃度(EC50)的計算同上。

2 結果與分析

2.1 PDB 培養基和查氏培養基菌株發酵液濃縮液的總抗氧化能力(T-AOC)的測定

由圖1、圖2 可知，蒺藜內生真菌在兩種培養基發酵條件下，均有一定的抗氧化作用，但在兩種培養基中發酵產物的抗氧化活性存在一定的差異。PDB培養基發酵條件下，總抗氧化能力最高的是JL13，其次為JL14，最低的是JL3，大約是JL13 活性的四分之一;查氏培養基發酵條件下，菌株生長速度較慢且總抗氧化能力普遍較低，其中JL31 的總抗氧化能力最強，其次為JL13，JL26 活性最低，只有JL31 活性的十二分之一。結果可能提示，不同發酵培養基對蒺藜內生真菌發酵產物的抗氧化活性有一定的影響，因此選出兩種培養基發酵條件下總抗氧化能力都較強的前9 株菌株進行下一步的篩選，且發酵培養基都選用PDB 培養基。

圖1 PDB 培養基發酵條件下總抗氧化能力較強的前十二株菌株Fig.1 The 12 active strains of better antioxidant capacity fermented in PDB

圖2 查氏培養基發酵條件總抗氧化能力較強的前十二株菌株Fig.2 The 12 active strains of better antioxidant capacity fermented in Czapek's medium

2.2 9 株菌株對DPPH·自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除作用

由圖3 可知，總抗氧化能力較強的前9 株菌株中，對DPPH 自由基的清除率接近50%或大于50%的蒺藜內生真菌有四株，依次是JL13、JL26、JL14 和JL17;對羥基自由基的清除率大于50%的蒺藜內生真菌共有6 株，依次是JL17、JL13、JL26、JL7W、JL3和JL14;對超氧陰離子自由基的清除率大于50%的蒺藜內生真菌也有6 株，依次為JL13、JL14、JL17、JL31、JL16 和JL7W。上述結果顯示，對三種自由基的清除作用均表現較好活性的菌株共有三株，分別為JL13、JL14 和JL17，這與前面實驗中PDB 培養基發酵條件下總抗氧化能力的測定結果基本一致;且此三株菌株均屬于莖點霉屬，可能提示，蒺藜內生真菌菌株中莖點霉屬和其它菌屬相比，發酵產物具有較好的抗氧化活性。實驗室前期研究顯示蒺藜內生真菌發酵產物的乙酸乙酯萃取部位有較好的生物活性，因此本研究進一步評價了JL13，JL14 和JL17 發酵產物的乙酸乙酯萃取物清除自由基的能力。

圖3 9 株菌株對DPPH·自由基、OH·自由基和自由基的清除作用Fig.3 Scavenging activities of the 9 strains on DPPH，hydroxyl radical and superoxide radical

2.3 JL13、JL14、JL17 發酵產物乙酸乙酯萃取物對DPPH·自由基，OH·自由基和自由基的清除作用

2.3.1 對DPPH·自由基的清除作用

由圖4 可知，三株菌株發酵產物的乙酸乙酯萃取物對DPPH·自由基的清除作用在一定范圍內呈一定的量效關系。JL13 在500 μg/mL 時對DPPH·自由基的清除作用即達到90.33%，經結果計算得EC50為149. 67 μg/mL;JL14 在5000 μg/mL 時對DPPH·自由基的清除作用能達到93.49%，經計算得EC50為1.29 mg/mL;JL17 對DPPH 自由基的清除能力相對較弱，在最大濃度5 mg/mL 時清除率僅為35.73%。上述結果表明，JL13 乙酸乙酯萃取物對DPPH·自由基的清除能力最好，其次是JL14，JL17 活性最差。

圖4 JL13，JL14，JL17 發酵產物乙酸乙酯萃取物對DPPH·自由基的清除作用Fig.4 Scavenging activities of the ethyl acetate extracts of JL13，JL14 and JL17 on DPPH· radical

2.3.2 對OH·自由基的清除作用

由圖5 可知，三株菌株發酵產物的乙酸乙酯萃取物對OH·自由基的清除作用呈一定的量效關系，隨濃度的升高而增強。JL13 在5 mg/mL 時對OH·自由基的清除作用可達到90. 16%，經計算EC50為439.91 μg/mL;其次是JL14，5000 μg/mL 時對OH·自由基的清除率可達45.78%，經計算EC50為10.25461 mg/mL;JL17 對DPPH 自由基的清除能力相對較弱，在最大濃度5 mg/mL 時清除率僅為28.89%。結果顯示，JL13 乙酸乙酯萃取物有較好的清除羥基自由基的能力。

圖5 JL13，JL14，JL17 發酵產物乙酸乙酯萃取物對OH·自由基的清除作用Fig.5 Scavenging activities of the ethyl acetate extracts of JL13，JL14 and JL17 on hydroxyl radical

圖6 JL13、JL14、JL17 發酵產物的乙酸乙酯萃取物對自由基的清除作用Fig.6 Scavenging activities of the ethyl acetate extracts of JL13，JL14 and JL17 on superoxide radical

3 討論

目前關于活性氧的研究越來越引起人們的關注，國內外學者發現有機體的多種疾病都直接或間接的與自由基對機體的氧化損傷有關，因此尋找高效的天然抗氧化劑顯得十分重要。至今為止，很多研究已經證明植物內生真菌是一種很有潛力的天然抗氧化劑資源。如Kamolchanok Tianpanich 等［10］從Piper ornatumde(蘇拉威西胡椒)的一株內生真菌(Colletotrichum sp.)中分離到五個已知異香豆素類化合物和一個新的四氯苯肽化合物，都具有較好的抗氧化能力。其中第二個和第四個異香豆素類化合物對DPPH·自由基和OH·自由基都有很強的清除作用，EC50分別為23. 4 μM、16. 4 μM 和52. 6 μM、4.3 μM，且第二個異香豆素類化合物還可選擇性的抑制HepG2 細胞系。

本實驗選擇共來自于10 個屬的21 株蒺藜內生真菌為研究對象，對其抗氧化和清除自由基的能力進行初步研究。結果顯示，21 株蒺藜內生真菌的發酵產物均有一定程度的抗氧化能力，具有潛在的開發利用價值，尤其是JL13 菌株表現較強的清除自由基的能力，加之其較易培養，因此被定為本實驗的最優良菌株，可作為進一步研究的對象。結果還顯示，培養基對菌株發酵產物的抗氧化能力有一定的影響，大部分菌株在PDB 培養基發酵條件下發酵產物的總氧化能力明顯高于查氏培養基發酵條件下的。這可能源于菌株在不同的培養基上產生的次生代謝產物是不同的，也可能因菌株在不同培養基上的生長速度不同造成抗氧化活性成分的產生量不同，而使菌株在不同的培養基上表現為不同的抗氧化活性。此外，實驗結果顯示，21 株蒺藜內生真菌中，莖點霉屬相對其它菌屬表現出較好的抗氧化活性。目前有國內外研究表明某些植物的內生真菌中，莖點霉屬在抗腫瘤和抑菌等活性方面表現出較好的作用，如陳毅堅等［11］發現來自莖點霉屬的兩株云南紅豆杉內生真菌和其它菌屬的菌株相比，紫杉醇產量最高;Angela M. Hoffma 等［12］從Saurauia scaberrinae的一株莖點霉屬內生真菌中分離到一種呋喃二酮化合物，有很強的抑菌活性。而關于莖點霉屬抗氧化活性的報道還比較少見，那么蒺藜內生真菌中，莖點霉屬在抗氧化活性上是不是也具有一定的優勢，還有待于繼續探討。

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