高速逆流色譜分離純化鉤吻中鉤吻素甲

劉 浩，沈 潔，劉 銘，許 盈，俞昌喜*

1福建醫科大學藥學院藥理學系，福州350004;2 武警福建總隊醫院藥劑科，福州350003

中國鉤吻為馬錢科植物胡蔓藤的全草，盛產于浙江、福建、廣東、廣西、湖南、貴州、云南等地［1］，本地區資源豐富。我國民間一直應用鉤吻原植物治療各類疼痛，尤其慢性神經性疼痛與癌性疼痛。鉤吻主要有效成分為吲哚類生物堿。臨床和基礎研究表明，鉤吻總生物堿具有顯著的抗腫瘤、鎮靜鎮痛、促進造血、抑制血小板聚集、免疫抑制等藥理作用［2，3］，但是治療量卻與中毒量較接近，限制了臨床應用。因此，從鉤吻總堿中分離得到高效低毒的生物堿單體成為新藥研發的目標。

從20 世紀30 年代起，我國學者趙承嘏等先后完成了鉤吻化學成分分析方面的研究［4-7］，鉤吻素甲是鉤吻生物堿中含量最高的兩種單體之一，且毒性相對較低［8］，使其研發成為可能，但是傳統采用的分離方法主要是堿性硅膠柱或氧化鋁柱色譜［4-7］，分離周期長，溶劑消耗大，得率低。本文采用的高速逆流色譜(high-speed counter current chromatography，HSCCC)是一種基于液液分配機理的新型色譜分離純化技術，可避免液固色譜造成的固體載體對樣品的不可逆吸附，分離效率高、周期短、回收率高、制備量大［9］。本文首次采用HSCCC 技術分離純化鉤吻素甲，以建立鉤吻素甲的一種高效分離純化的制備技術。

圖1 鉤吻素甲的化學結構Fig.1 Chemical structure of gelsemine

1 材料與儀器

TBE-300A 高速逆流色譜儀(中國上海同田生化技術有限公司);TBP-50A 恒流泵(上海同田生物技術有限公司);TBD-23 紫外檢測器(上海同田生物技術有限公司);DBS-100 電腦全自動部分收集器(上海青浦滬西儀器廠);HX-1050 恒溫循環器(北京博醫康實驗儀器有限公司);1100 高效液相色譜儀(美國Angilent 公司);依利特Hypersil ODS2 高效液相色譜柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)(大連依利特分析儀器有限公司);Avance III 400 MHz 核磁共振儀(瑞士Bruker 公司);LCQ 離子阱質譜儀(美國Finnigan Thermo Electron 公司)。

鉤吻原生藥材采集于福州市，經過本課題組生藥學研究鑒定為中國鉤吻的全草［10］。實驗中所用的乙醇、氯仿、甲醇為分析純，購自天津巴斯夫化工有限公司;高效液相色譜(HPLC)分析用甲醇為色譜純，購自中國國藥集團化學試劑有限公司;實驗用水為自制重蒸水。

清潔級ICR 小鼠，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號:SCXK(滬)2009-0005。體重18～23 g。光暗周期12/12 h(光照時間8:00～20:00)下恒溫(23 ±2 ℃)、恒濕度(50 ±5%)環境飼養，自由飲水飲食。所有針對小鼠的實驗操作都遵守國際和本地實驗動物使用和保護委員會頒布的條例。

2 方法與結果

2.1 鉤吻粗提物的制備

取曬干的鉤吻植物的根和莖適量，粉碎后過40目篩，稱取鉤吻粗粉500 g，加入3000 mL 95%乙醇中浸泡過夜，用90 ℃水浴加熱回流提取3 小時后，過濾，重復上述步驟，共回流提取3 次，合并濾液，45℃減壓蒸餾至無醇味，呈深棕色浸膏狀。加入2%鹽酸300 mL 溶解浸膏，調節pH 為2，放置過夜。將前一天靜置的溶液抽濾，濾渣(變為深綠色)再加入100 mL 2%鹽酸振搖后抽濾，合并濾液;濾液用50 mL 乙醚萃取，除去脂質和色素;乙醚重復萃取1 次后，沿玻棒緩慢加入100 mL 5 mol/L NaOH，使pH大于11，生成紅棕色沉淀;然后用氯仿和乙酸乙酯分別萃取3 次，合并萃取液，45 ℃減壓蒸餾后獲得鉤吻總堿浸膏3.06 g，提取率為0.61%。

2.2 HSCCC 溶劑體系的選擇

采用HSCCC 分離天然產物中的化學成分，溶劑體系的選擇至關重要。目前常用HPLC 法測定組分在不同溶劑體系中的分配系數來指導溶劑體系選擇:配制各種比例溶劑體系，靜置2 h。取適量鉤吻總生物堿提取物，加入兩相體系中的下相中充分溶解，用HPLC 法測定下相中目標單體的峰面積(A1)。然后再加入等體積上相，將上下兩相劇烈振蕩充分混合，待生物堿在兩相中分配完全后，測定下相中目標單體的峰面積(A2)。HPLC 測定時兩次下相的進樣體積相同。計算分配系數［K =(A1-A2)/A2］，K 值一般在0.2 到2 之間，以1 左右為宜，各組分分離因子(各組分K 值比)應大于1.5［11］。這樣選定的溶劑體系只是初步估計，與HSCCC 實際結果可能還存在出入。

本研究根據鉤吻生物堿的化學性質，考慮到鉤吻總堿中組分較多，經過摸索，選擇分離中等極性化合物的溶劑體系:正己烷-乙酸乙酯-無水乙醇-水體系和氯仿-甲醇-0.2 mol/L HCl 體系，取得了較好的分離效果。

2.3 HSCCC 儀器參數的優化

影響分離效果的儀器參數包括泵的流速、主機轉速、恒溫浴槽的循環水溫。

2.3.1 泵的流速

流速越快則分離時間越短，分離效果越不理想;流速越慢則分離效果越好，分離時間越長。本課題組考察了1.0、1.5、2.0 mL/min 等流速，其中流速為1.5 mL/min 時分離效果最好。

2.3.2 主機的轉速

由于兩相溶劑體系容易產生氣泡，為了盡量減少氣泡對分離效果和儀器管路造成的不利影響，實驗之前先將上下相超聲脫氣30 min，同時在不影響分離效果的前提下盡量減慢轉速，實驗發現轉速850 rpm 比較合適。

2.3.3 循環水溫

循環水溫對分離效果影響不大，最終選用常溫25 ℃作為分離溫度。

2.4 鉤吻素甲的分離純化

配制正己烷-乙酸乙酯-無水乙醇-水(3:3:2:3 V/V)為溶劑體系，充分混勻后靜置過夜。使用前分離溶劑體系的上下相，上相為固定相，下相為流動相，分別超聲30 min。300 mg 鉤吻總堿超聲溶解在15 mL 下相中備用。將上相泵入高速逆流色譜儀主機，待上相從管道出口流出時，開啟恒溫循環器，調節溫度至25 ℃，設定流速為1.5 mL/min，泵入下相，同時開啟HSCCC 主機，由首端向尾端正轉洗脫，轉速為850 rpm。當流動相從主機出口流出，表明體系已經達到流體動力學平衡，此時將樣品倒吸入儀器螺旋管柱內，檢測波長為254 nm。應用N2000 色譜工作站采集紫外吸收信號，并根據色譜峰分段收集樣品，上相保留率為71.3%。

將收集到的鉤吻HSCCC 峰組分進行HPLC 分析，色譜條件參照2.6.1 項，根據HPLC 分析結果，將只含有目標成分I 與另一成分II 的收集液合并，于45 ℃減壓旋轉蒸發溶劑后，作為新的分離樣品。

配置氯仿-甲醇-0.2 mol/L HCl(4:3:1.5 V/V)溶劑體系，參照上述HSCCC 操作(上相保留率為66%)，將主要含有兩個組分的新分離樣品進行進一步分離，經HPLC 檢測分析(色譜條件參照方法2.6.1 項)，將高純度的目標組分HSCCC 洗脫液合并，采用減壓旋轉蒸發的方法濃縮樣品，真空干燥獲得白色固體粉末。300 mg 鉤吻總堿粗品經兩次HSCCC 分離純化，可得到30.78 mg 單體。其HSCCC 分離過程的色譜圖見圖2、圖3。

2.5 質譜和核磁共振分析

對分離得到的鉤吻單體選用質譜、核磁共振氫譜、碳譜等分析方法進行結構確證。

ESI-MS m/z 323.4 (M+H+)，其相對分子質量應為322.4;1H NMR (CDCl3，TMS)δ:3.82 (1H，s，H-3)，2. 76 (3H，s，Nb-CH3)，4. 11 (1H，s，H-5)，2.26 (1H，s，H-6)，7.42 (1H，d，H-9)，7.19 (1H，t，H-10)，7. 27 (1H，t，H-11)，7. 01 (1H，t，H-12)，2.84 (1H，d，H-14α)，2.00 (1H，ddd，H-14β)，2.44(1H，t，H-15)，2.97 (1H，s，H-16)，4.10 (2H，s，H-17)，5. 10 (1H，d，H-18a)，4. 95 (1H，d，H-18b)，6.25 (1H，dd，H-19)，2. 84 (1H，d，H-21β)，3. 45(1H，s，H-21α);13C NMR (CDCl3，TMS)δ:178. 9(C-2)，140.2 (C-13)，138.6 (C-19)，131.9 (C-8)，128.4 (C-9)，128.0 (C-11)，121.9 (C-10)，112.3(C-18)，109.0 (C-12)，72.2 (C-5)，69.5 (C-3)，66.3 (C-21)，61.6 (C-17)，54.1 (C-7)，54.1 (C-20)，50.7 (N-CH3)，40.8 (C-6)，38.3 (C-15)，35.8(C-16)，22.9 (C-14)。經與文獻報道［12，13］數據對照，確定該化合物為鉤吻素甲。

2.6 組分的質量分數的HPLC 法測定

2.6.1 色譜條件

色譜柱為依利特Hypersil ODS2 高效液相色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5μm)(大連依利特分析儀器有限公司);流動相為甲醇-0.2%正丁胺水溶液(50∶50);二極管陣列檢測器;體積流量為1.0 mL/min;檢測波長為256 nm;柱溫為25 ℃。

2.6.2 紫外法測定結果

經HSCCC 分離得到的目標組分在高效液相色譜190～600 nm 波長掃描發現，樣品在不同檢測波長中均為單一的色譜峰。

圖4 HSCCC 分離純化后得到的鉤吻素甲的HPLC 色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of purified gelsemine

2.6.3 HPLC 法測定結果

采用面積歸一化法計算鉤吻素甲的質量分數為97.76%，見圖4。

2.7 小鼠醋酸扭體法檢測鉤吻總堿與鉤吻素甲的鎮痛活性

小鼠醋酸扭體模型的建立:小鼠置于不透光的圓筒(直徑30 cm，高45 cm)內適應30 min，經過藥物處理一定時間之后，每只小鼠腹腔注射0.2 mL(0.1 mL/10 g)0.6%冰醋酸，而后放入圓筒內對小鼠進行觀察。當小鼠出現典型的腹部內凹，同時伴有軀干扭曲，臀部抬高以及后肢伸長等特征性反應時，認為是一次扭體的發生。記錄15 min 內小鼠的扭體次數以反映小鼠的疼痛程度。實驗時室溫保持在22～26 ℃，實驗時間段一致，環境室溫22 ±1 ℃，濕度55 ±10%。

2.7.1 鉤吻總堿的鎮痛活性

在小鼠醋酸扭體模型的基礎上，觀察鉤吻總堿對醋酸誘導的炎性自發痛的影響:小鼠隨機分為生理鹽水對照組、鉤吻總堿高、中、低劑量組以及嗎啡對照組，每組10 只。鉤吻素甲高、中、低劑量組小鼠i.p.給予鉤吻總堿0.6、0.4、0.2 mg/kg，嗎啡對照組i.p.給予嗎啡10 mg/kg，生理鹽水對照組i.p.給予相同體積的生理鹽水，30 min 后各組動物i.p.給予0.6%冰醋酸10 mL/kg，觀察15 min 小鼠的扭體次數。結果見表1。

表1 鉤吻總堿對醋酸所致小鼠扭體行為的影響Table 1 Effect of the total alkaloids from G.elegan s on writhing behavior of mice induced by acetic acid

結果顯示，鉤吻總堿高、中、低劑量組與生理鹽水組相比，扭體次數明顯減少(P ＜0.001)，扭體抑制率呈劑量依賴性。嗎啡組扭體抑制，鎮痛作用顯著。提示鉤吻總堿可能具有較強的抗炎性疼痛作用，但其作用弱于嗎啡。

2.7.2 鉤吻素甲的鎮痛活性

在小鼠醋酸扭體模型的基礎上，觀察本實驗分離純化所獲得鉤吻素甲對醋酸誘導的炎性自發痛的影響:小鼠隨機分為生理鹽水空白對照組、鉤吻素甲高、中、低劑量組以及阿司匹林對照組，每組18～29只。鉤吻素甲高、中、低劑量組小鼠s. c. 給予鉤吻素甲10、2、0.4 mg/kg，阿司匹林對照組s.c.給予阿司匹林100 mg/kg，生理鹽水對照組s. c. 給予相同體積的生理鹽水，30 min 后各組動物i. p. 給予0.6%冰醋酸10 mL/kg，觀察15 min 小鼠的扭體次數。結果見表2。

表2 鉤吻素甲對醋酸所致小鼠扭體行為的影響Table 2 Effect of gelsemine on writhing behavior induced by acetic acid in mice

結果顯示，鉤吻素甲高、中、低劑量組與生理鹽水組相比，小鼠的扭體次數明顯減少(低劑量組P＜0.05，中劑量組P ＜0.01，高劑量組P ＜0.001)，且扭體抑制率呈劑量依賴性。阿司匹林組的扭體次數與生理鹽水組相比也顯著減少(P ＜0.001)。提示鉤吻素甲可能對炎性疼痛具有鎮痛作用。

3 討論

我國學者很早就完成了鉤吻生物堿單體化學成分方面的研究，但是后續的藥理方面的研究卻遲遲沒有展開，其重要原因之一可能就是由于當時分離技術主要采用色譜柱層析［4-7］，分離周期長，溶劑消耗量大，得率低，可能分離得到的單體量比較少，不足以進行后續研究。而本課題組在鉤吻單體制備工藝上取得了突破，采用先進的高速逆流色譜技術進行鉤吻生物堿的分離，前面已經報道分離得到鉤吻素己和1-甲氧基鉤吻堿［14］，本實驗則把鉤吻素甲作為分離的目標組分，一次進樣300 mg 鉤吻總堿，經過兩次HSCCC 可以分離得到高純度的鉤吻素甲30.78 mg，一次HSCCC 一天就可以完成，分離周期短，得率高，分離效果好，操作簡單，優勢明顯。高速逆流色譜法為鉤吻生物堿單體的研發提供了一種高效的分離制備方法，為下一步的研究打下堅實的基礎。如果在制備型高速逆流色譜儀上進行放大制備，進樣量可以達到克～100 克量級，產量很大。在HSCCC 基礎上本課題組蘇燕評等嘗試采用pH 區帶精制逆流色譜(pH-zone-refining CCC)分離鉤吻總堿［15］，取得很好的效果，總堿進樣量達到1 克，得到的單體量可達幾百毫克。因此，HSCCC 技術將有可能發展成為鉤吻生物堿產業化應用的高效分離純化手段。我們還可以針對天然藥物分離工作中的特點，使用HSCCC 與其他技術相結合，例如正交軸逆流色譜(X-axis CPC)、雙向逆流色譜(DuCCC)以及上面提到的pH 區帶精制逆流色譜(pH-zone-refining CCC)等新技術，使其在生物堿分離純化方面的應用更加廣泛。

小鼠醋酸扭體實驗模擬的是一種腹腔炎癥所引起的疼痛狀態，醋酸所致扭體反應持續時間在15 min 到1 h 左右，其內臟炎性痛的機制較復雜。醋酸扭體實驗因其成本較低且操作簡單，現已成為一種經典的用于鎮痛藥篩選的動物模型，其特點是無論對于中樞性鎮痛藥還是外周性鎮痛藥均具有較高的敏感性。本研究采用小鼠醋酸扭體模型對鉤吻總堿和鉤吻素甲的抗炎鎮痛活性進行了初步探索，結果表明鉤吻總堿與鉤吻素甲均可明顯抑制小鼠扭體反應，抗醋酸所致炎性疼痛作用呈劑量依賴性。

藥物從天然產物提取出來的過程中可能由于物理或者化學的作用生成外消旋體或者手性藥物，從而導致藥物活性的丟失。本實驗中鉤吻總堿的鎮痛活性顯著，鉤吻素甲經過高速逆流色譜分離純化后，對小鼠炎性疼痛仍然具有明顯的鎮痛作用，說明提取過程藥物活性得到很好的保留，并沒有由于手性原因丟失鎮痛活性，提取方法高速有效，可以用于鉤吻生物堿的制備。

由于鉤吻總堿組分多，毒性強，雖有鎮痛作用，卻難于應用于臨床。本課題組已分離得到鉤吻素己，但其被認為是中國鉤吻生物堿中毒性最強的，且含量較少，應用受到限制;本實驗分離得到的鉤吻素甲單體毒性較弱，含量很高，在中國鉤吻中的僅次于鉤吻素子［8］，具有潛在的解熱鎮痛抗炎活性，有望開發成新型的鎮痛藥。有關鉤吻素甲的藥理活性以及毒理作用，有待于今后進一步研究。

1 Chen YS(陳翼勝).Poisonous plants in China(中國有毒植物).Beijing:Science Press，1990.371-376.

2 Liu H(劉浩)，Yu CX(俞昌喜).Research progress of Gelsemium elegans Benth..J Fujian Med Univ (福建醫科大學學報)，2008，42:469-472.

3 Chi DB(遲德彪)，Yang HX(楊鴻軒)，Zheng YS(鄭有順).Research progress of Gelsemium elegans Benth.. Pharmacol Clin Chin Mater Med (中藥藥理與臨床)，2001，17(2):48-49.

4 Chou TQ(趙承嘏). The alkaloids of Chinese Gelsemium Kou-Wen Gelsemium elegans Benth.. Chin J Physiol (中國生理學雜志)，1931，5:345-352.

5 Chou TQ(趙承嘏).The alkaloids of Chinese Gelsemium Ta-Cha-Yen.Chin J Physiol (中國生理學雜志)，1936，10:79-84.

6 Liu ZJ(劉鑄晉)，Lu RR(陸仁榮)，Zhu ZQ(朱子清)，et al.Gelsemium alkaloids I.Reinvestigation of the alkaloids of Kou-Wen，Gelsemium elegans Benth. and the constitution of koumine.Acta Chimica Sin (化學學報)，1961，27:47-58.

7 Yang JS(楊峻山)，Chen YW(陳玉武).Chemical study on Gelsemium alkaloids I.Separation of the alkaloids and structure of humantenmine.Acta Pharm Sin (藥學學報)，1983，18:104-112.

8 Yi JE(易金娥)，Yuan H(袁慧).Research and development on enterotoxin of Gelsemium Elegans Benth..J Hunan Envir-Biol Polytech (湖南環境生物職業技術學院學報)，2002，8(4):26-30.

9 Wang W(王尉)，Du N(杜寧)，Zhou XJ(周曉晶)，et al. Application of high-speed countercurrent chromatography in the research of natural botanic products.Mod Sci Inst (現代科學儀器)，2010，8:123-128.

10 Liu H(劉浩)，Xu Y(許盈)，Shi DM(石冬梅)，et al.Pharmacognostical study on the Gelsemium elegans Benth.from Fuzhou.Strait Pharm J (海峽藥學)，2008，20(4):62-64.

11 Zheng W(鄭衛).Application of counter-current chromatography in the separation of antibiotics. Chin J Antibiotics(中國抗生素雜志)，2005，30:180-186.

12 Lin LZ，Yeh S，Geoffrey AC，et al. Three oxindole alkaloids from Gelsemium species.Phytochemistry，1991，30:679-683.

13 Jin HL(金浩侖)，Xu RS(徐任生).Studies on the alkaloids of Gelsemium Elegans Benth.-the structure of koumidine.Acta Chimica Sin (化學學報)，1982，40:1129-1135.

14 Shen J(沈潔)，Su YP(蘇燕評)，Xu Y(許盈)，et al.Isolation and purification of gelsenicine and gelsevirine from Gelsemium elegans by high-speed counter-current chromatography. Chin Tradit Herb Drugs (中草 藥)，2009，40:1392-1395.

15 Su YP，Shen J，Xu Y，et al.Preparative separation of alkaloids from Gelsemium elegans Benth. using pH-zone-refining counter-current chromatography. J Chromato A，2011，1218:3695-3698.