不同產地懷牛膝β－蛻皮甾酮含量測定及指紋圖譜研究

張留記 ，孫丹丹，屠萬倩，劉欽松

1河南中醫學院，鄭州450008;2河南省中醫藥研究院，鄭州450004

牛膝為莧科植物牛膝Achyranthes bidentata Bl.的干燥根，是中國藥典2010 年版一部收載品種，具有補肝腎、強筋骨、通血脈、降血壓及鎮痛等功效［1］，用于經閉、痛經、腰膝酸痛、筋骨無力、淋癥、水腫、頭痛、眩暈、牙痛、口瘡、吐血、衄血等癥的治療［2］。牛膝主產于河南焦作(古懷慶府)，是河南“四大懷藥”之一，種植歷史悠久、質量優良、產量較大，被認為《本經》所載上品牛膝［3］。作為大宗常用中藥品種，牛膝的市場需求量較大，在我國河北、山東、內蒙、安徽等不同地區也有規?；N植。牛膝中含有甾體、甾酮、皂苷、異黃酮和多糖等多種成分［4-6］，其中β-蛻皮甾酮(β-ecdysterone，EDS)為含量較高的三萜甾酮類成分。研究表明，牛膝中的三萜及蛻皮甾酮有抑制破骨細胞分化、促成骨樣細胞增殖活性，促進蛋白質的合成作用;抑制由于藥物引起的血糖升高，降膽固醇作用;使受損的細胞再生，與牛膝“補肝腎、強筋骨”功效相吻合［7，8］。中國藥典2010 年版一部中牛膝藥材的質量標準中采用HPLC 法建立了β-蛻皮甾酮的含量測定方法［9］?？紤]到懷牛膝藥材中化學成分較復雜，單一化學成分的含量測定不能全面反映藥材的內在質量，指紋圖譜技術能較好的表征中藥的整體特征性，兼具一定的模糊性，已有對武陟等河南出產的牛膝進行了指紋圖譜的研究報道［10，11］，但實驗樣品僅局限于河南主產的部分懷牛膝樣品，對國內其他產地的牛膝未進行測定和比較。本文對不同產地的牛膝藥材中β-蛻皮甾酮進行了含量測定，根據HPLC 色譜建立了懷牛膝的指紋圖譜，在同一色譜條件下完成牛膝的定性定量，為今后懷牛膝的質量評價和道地性研究提供參考。

1 材料

美國Waters 高效液相色譜儀(2695 溶劑管理系統，2996 二極管陣列檢測器，美國Waters 柱溫箱，Empower II 工作站);Waters SunFire C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm);AE240 十萬分之一分析天平(瑞士METTLER 公司);LIBROR-160DPT 萬分之一分析天平(日本島津);甲醇、乙腈為色譜純(德國Merck 試劑公司)，其余試劑為分析純，蒸餾水購自鄭州市大成蒸餾水廠，重蒸餾水自制。對照品β-蛻皮甾酮(購自中國藥品生物制品檢定所，批號:111638-200301，為含量測定用對照品)。懷牛膝對照藥材購自中國藥品生物制品檢定所(批號:1006-2002203);供試藥材來源見1，經河南省中醫藥研究院都恒青研究員鑒定均為莧科植物牛膝A.bidentata Bl.的干燥根，憑證標本存放于河南省中醫藥研究院中藥室。

表1 不同產地的牛膝藥材來源Table 1 Samples of A.bidentata Bl.from different areas

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Waters SunFire C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm);流動相A:甲醇，流動相B:水，柱溫30 ℃;流速1.0 mL/min;檢測波長250 nm;記錄時間90 min;進樣量10 μL。

表2 梯度洗脫時間程序Table 2 Gradient elution profile of mobile phases

2.2 供試品溶液的制備

取懷牛膝粉末(過四號篩)約1 g，精密稱定，置具塞三角瓶中，加甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減輕的重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液25 mL，回收溶劑并濃縮至干，殘渣加水10 mL 溶解后，用水飽和的正丁醇提取5 次，每次10 mL，合并正丁醇液，用水15 mL 洗滌，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉移至5 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.3 對照品溶液的制備

精密稱取β-蛻皮甾酮對照品1.30 mg 置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL 含β-蛻皮甾酮0.13 mg 的溶液，以0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得。

2.4 β-蛻皮甾酮含量測定

2.4.1 線性關系考察

取“2.3 對照品溶液的制備”項下制得的對照品溶液，進樣2、5、10、15、20 μL，按“2.1 色譜條件”測定β-蛻皮甾酮色譜峰峰面積，以峰面積為縱坐標(Y)，進樣量為橫坐標(X)，進行回歸處理，得回歸方程:Y=1.59 ×106X-2.26 ×104，r =0.9994。結果表明，β-蛻皮甾酮在0.26 μg～2.60 μg 范圍內，進樣量與峰面積之間呈良好的線性關系。

2.4.2 加樣回收率試驗

取已知含量的樣品(β-蛻皮甾酮含量為0.634 mg/g)，取約0.5 g，精密稱定，置三角燒瓶中，精密加入濃度為0.00584 mg/mL 的β-蛻皮甾酮對照品溶液50 mL，以下按“2.2 供試品溶液的制備”項下方法操作，制備加樣回收供試品溶液。精密吸取加樣回收供試品溶液20 μL，注入液相色譜儀，按“2.1色譜條件”測定加樣供試品溶液中β-蛻皮甾酮的含量，計算回收率，結果見表3。

表3 β-蛻皮甾酮的加樣回收試驗結果Table 3 Recoveries of β-ecdysterone

2.4.3 不同產地懷牛膝中β-蛻皮甾酮含量測定

取不同產地懷牛膝樣品，按“2.2 供試品溶液的制備”項下方法操作，制備供試品溶液，分別測定其含量，結果見表4。

表4 不同產地懷牛膝藥材β-蛻皮甾酮含量測定結果Table 4 Quantification results of β-ecdysterone in samples from different areas

0.5803 0.058 3 0.5354 0.054 4 0.6537 0.065 5 0.5116 0.051 6 0.6114 0.061 7 0.7175 0.072 8 0.6116 0.061 9 0.6349 0.063 10 0.6228 0.062 11 0.6137 0.061 2

12 0.6337 0.063 13 0.6998 0.070 14 0.7708 0.077 15 0.6277 0.062 16 0.6045 0.060 17 0.4652 0.046 18 0.4810 0.048 19 0.5649 0.056 20 0.7240 0.072 21 0.4880 0.049

2.5 HPLC 指紋圖譜研究

2.5.1 精密度試驗

取5 號樣品，按“2.2 供試品溶液的制備”項下方法操作，制備供試品溶液，按“2.1 色譜條件”項下方法，連續6 次進樣，記錄色譜圖，計算各共有峰相對保留時間、相對峰面積的RSD 值，結果各共有峰的RSD 值均小于3%，表明精密度良好。

2.5.2 穩定性試驗

取5 號樣品，按“2.2 供試品溶液的制備”項下方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12 h 進行測定，記錄色譜圖，計算其各共有峰相對保留時間、相對峰面積的RSD 值，結果RSD 值均小于3%，表明12 h 內供試品溶液基本穩定。

2.5.3 重復性試驗

精密稱取5 號樣品粉末6 份，每份約1 g，按“2.2 供試品溶液的制備”項下方法操作，平行制備6 份供試品溶液。分別進樣測定，記錄色譜圖，計算其各共有峰相對保留時間、相對峰面積的RSD 值，結果RSD 值均小于3%，表明本實驗重復性良好。

2.5.4 懷牛膝的HPLC 色譜檢測

按“2.2 供試品溶液的制備”項下方法操作，制備供試品溶液，對15 批來自河南道地產區的懷牛膝藥材和6 批來自其他不同產地的牛膝藥材進行檢測，記錄色譜圖。β-蛻皮甾酮對照品溶液(EDS)及牛膝對照藥材(S11)HPLC 色譜圖見圖1。編號為1～9、12～17 的15 批道地懷牛膝藥材供試品的HPLC 色譜疊加圖(S1—S9，S12—S17)，見圖2。編號為10 的半野生牛膝(S10)、編號為11 的牛膝對照藥材(S11)和編號為18～21 的5 批其他產地的牛膝藥材供試品的HPLC 色譜疊加圖(S18—S21)，見圖3。

2.6 指紋圖譜的建立

2.6.1 參照峰的選擇

將懷牛膝對照品色譜圖與樣品色譜圖中保留時間相對應的色譜峰的紫外吸收光譜進行比較，結果完全一致，供試品色譜圖中3 號特征峰確定為β-蛻皮甾酮。各批次樣品圖譜中β-蛻皮甾酮的色譜峰分離良好，峰面積較大且為所有樣品共有，所以選擇β-蛻皮甾酮為參照峰。

2.6.2 不同產地懷牛膝藥材指紋圖譜及相似度評價

運用藥典委員會中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A 版軟件進行分析，將實驗數據導入中藥指紋圖譜相似度評價軟件，設定同一時期采集的同為二等品的12、13、14、15、16 號為參照圖譜，將色譜峰自動匹配，生成對照圖譜(見圖1、圖3 中的R)，進行相似度評價。通過中藥指紋圖譜相似度計算軟件得出道地懷牛膝藥材指紋圖譜的共有模式(即對照圖譜)，各樣品與該共有模式比較，其相似度結果如下:1—11 號分別為0.999、0.998、0.998、0.999、0.998、0. 998、0. 999、0. 958、0. 987、0. 985、0. 982。17—21 號 分 別 為0. 971、0. 949、0. 947、0. 979、0.916。通過建立懷牛膝藥材的HPLC 指紋圖譜，確定了7 個共有峰，以3 號共有峰牛膝β-蛻皮甾酮為參照峰，計算21 批懷牛膝藥材其他共有峰的相對峰面積，結果見表5。

表5 21 批牛膝藥材共有峰相對峰面積比值Table 5 Relative peak area of the 7 common peaks of 21 batches of A.bidentata Bl.

3 討論

3.1 測定方法和儀器的選擇

考慮到HPLC 方法成熟，儀器普及率較高，利用該儀器建立懷牛膝中β-蛻皮甾酮含量測定方法和指紋圖譜方法，對儀器設備的要求相對較低，所建立方法易重復、易推廣，而UPLC、HPLC-MS/MS、HPLC-TOF-MS、UPLC-MS/MS 等先進分析儀器價格昂貴，普及率相對較低，本文所采用的方法具有普遍適用性的特點。

3.2 供試品提取溶劑、提取方法的選擇

在實驗中，試用了甲醇、水飽和正丁醇、95%乙醇等不同提取溶劑制備供試品溶液。結果表明，以甲醇作為提取溶劑，HPLC 色譜峰較為豐富，提取β-蛻皮甾酮較為完全，故選擇甲醇作為提取溶劑。對加熱回流、超聲處理、索氏提取等不同提取方式進行考察，結果三種方式提取效率相仿，但超聲具有提取快速、操作簡便的特點，故采用超聲為供試品溶液的提取方法。在試驗中，還比較了20、30、50 min 等不同超聲處理時間，結果超聲處理20 min 的供試品色譜吸收明顯弱于超聲30 min 和50 min 供試品，超聲處理30 min 的圖譜與50 min 的圖譜色譜峰數量、峰面積基本一致，提取30 min 后，各成份已基本提取完全。根據以上實驗結果，選擇以甲醇溶劑，超聲提取30 min 作為提取方法。為獲得理想的色譜條件，在供試品制備過程中，根據β-蛻皮甾酮等植物甾酮的理化性質，甲醇超聲處理后，經水飽和正丁醇萃取和水洗滌等精制除雜步驟，樣品中主要特征峰分離度良好，峰型對稱。

3.3 色譜條件的選擇

為獲得更豐富的色譜峰信息，在實驗中先后比較了乙腈-1%甲酸溶液、乙腈-0.4%磷酸溶液、乙腈-水、甲醇-0.4%磷酸溶液和甲醇-水等多種色譜系統和梯度洗脫程序，結果采用甲醇-水系統，按本文選定的時間程序洗脫，各色譜峰的分離度較好，且峰形對稱性好。

3.4 掃描波長的選擇

采用二極管陣列檢測器在200 nm～400 nm 對供試品色譜進行全波長掃描，得到三維全波長紫外掃描圖，結果表明在250 nm 波長處各吸收峰吸收均較強，且懷牛膝主要特征成分β-蛻皮甾酮在此處響應值較高，故選擇250 nm 作為檢測波長。

3.5 柱溫的選擇

考查了不同溫度(室溫、40 ℃、30 ℃)對色譜峰的影響，室溫出峰時間較長，部分吸收峰有輕微拖尾，柱溫40 ℃時出峰較迅速，1、2、4 號峰等主要色譜峰與相鄰峰未能達到基線分離，30 ℃時色譜峰保留時間相應延長，但分離較好，出峰時間適宜，因此選擇柱溫為30 ℃。

3.6 道地與非道地產區懷牛膝β-蛻皮甾酮含量分析

運用SPASS 13.0 軟件，對道地和非道地懷牛膝中β-蛻皮甾酮含量進行分析，道地產區藥材含量高于非道地產區藥材，通過F 檢驗結果顯示，不同產地間懷牛膝中β-蛻皮甾酮含量無顯著性差異。

3.7 不同等級懷牛膝中β-蛻皮甾酮含量分析

運用SPASS 13.0 統計學軟件，對四個不同等級懷牛膝藥材中β-蛻皮甾酮含量分別進行比較分析，結果發現，二等品＞三等品＞一等品＞四等品;在P=0.05 的水平下，四等懷牛膝中β-蛻皮甾酮含量與三等和二等懷牛膝中含量差異有統計學意義;其他水平間的含量差異無統計學意義。

3.8 建立懷牛膝藥材的HPLC 指紋圖譜

在實驗中，對來自道地藥材產區不同產地的懷牛膝進行指紋圖譜研究，建立了懷牛膝中甾酮類成分的HPLC 指紋圖譜對照圖譜;通過對15 批來自不同產地的懷牛膝進行測定和分析，所建立的對照指紋圖譜具有一定代表性，能夠反映懷牛膝中β-蛻皮甾酮等甾酮類化合物的組成及相對比例，既可用于定性鑒別，又可起到半定量分析的作用，為河南道地藥材懷牛膝的質量評價提供了新的科學方法和數據。

3.9 相似度分析

應用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2004A 版)進行圖譜分析，結果表明，不同產地牛膝的相關系數有一定的差異。河南道地藥材懷牛膝相似度均大于0.95，而河北、亳州等其他產地的牛膝的相似度則低于0.95，本實驗所建方法可為區分道地藥材和非道地藥材提供一定的參考依據。

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