雙酶法酶解豌豆蛋白制備高抗氧化多肽的研究

張秋萍，田亞平

江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，無錫214122

豌豆(Pisum sativum L.)屬豆科植物，是僅次于大豆、花生、菜豆的世界第四大豆類作物，我國是世界第二大豌豆生產國［1］。豌豆具有富淀粉、高蛋白、低脂肪特點，淀粉和蛋白質含量分別約占52%和25%，我國市場上主要利用豌豆中富淀粉的特點生產粉絲，對蛋白的研究開發利用相對較低。據報道［2］豌豆蛋白是必需氨基酸的很好來源，與其他豆類作物相比組成模式比較接近FAO/WHO 推薦的標準模式;豌豆蛋白的生物價(BV)為48%～64%，高于大豆蛋白。因此對豌豆蛋白產品進行研究開發不僅有利于充分利用豌豆蛋白資源，還具有改善我國人民膳食結構、促進健康的作用。

生物活性肽一般由2～20 個氨基酸組成的多肽，它存在于沒有活性或活性相對較低的大分子蛋白中。因此可以通過蛋白酶的酶解產生生物活性肽，增加蛋白的利用率。國內對豌豆蛋白的研究主要集中在豌豆蛋白制備工藝優化和使用不同蛋白酶酶解豌豆蛋白的條件優化上，而對酶解產物性能研究較少。國外學者Li H et al.［3］已用提純的豌豆蛋白水解液進行小鼠實驗證實了具有防治腎病及腎病引起的高血壓作用;Pownall T L et al.［4］探究了嗜熱菌蛋白酶解豌豆蛋白生成的小分子肽經反相層析分離出各組分的抗氧化性大小與氨基酸組成之間的關系。

由于每種蛋白酶根據特定的作用位點對蛋白進行酶解，單酶水解對蛋白的作用范圍小，采用雙酶或兩種以上的蛋白酶協同水解蛋白往往會得到更好效果［5］。本研究優選雙酶分步酶解豌豆分離蛋白制備抗氧化肽，并通過兩種層析法分離出具有高抗氧化性的多肽，為更好地開發和利用植物蛋白酶解深加工產物創造良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

豌豆分離蛋白粉(蛋白含量75%)，山東健源食品有限公司提供;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，Sigma 公司;胰蛋白酶(4 ×104U/g)、木瓜蛋白酶(2 ×105U/g)、2709 堿性蛋白酶(1.5 ×105U/g)，廣西南寧龐博生物工程有限公司;1398 中性蛋白酶(1 ×105U/g)，蘇柯漢生物工程科技有限公司;鄰苯三酚、鄰氮二菲，國藥集團化學試劑有限公司;其他試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器

722 型紫外可見分光光度計(上海尤尼柯儀器有限公司);旋轉蒸發儀(鄭州市亞榮儀器有限公司);85-2A 數顯測速恒溫磁力攪拌器(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司);高速冷凍離心機Himac CR22G(日立HITACHI 集團);AKTA 蛋白質分析儀(通用電氣醫療集團)。

1.2 實驗方法

1.2.1 單酶水解豌豆蛋白

選用4 種蛋白酶(木瓜蛋白酶、1398 中性蛋白酶、胰蛋白酶、2709 堿性蛋白酶)在表1 條件下進行單酶水解豌豆蛋白。

將豌豆蛋白粉按照各自的最適底物濃度溶解于水中，90 ℃水浴15 min 進行預處理，冷卻后放在恒溫磁力攪拌器上邊攪拌邊調至各自反應最適的溫度和pH 值，隨后按照各自的酶底比(E/S)加入蛋白酶，開始進行水解反應，隨時滴加1 mol/L NaOH 保持酶解液pH 不變。以水解度(DH)為指標，充分酶解反應4 h 后，煮沸10 min 滅酶，冷卻后用1 mol/L NaOH 或1 mol/L HCl 調至pH 7。在8000 rpm 下離心15 min 去沉淀，以DPPH 清除率為指標測定不同酶解液的抗氧化能力。

表1 不同蛋白酶對豌豆分離蛋白的水解條件Table 1 Conditions for the hydrolysis of pea protein isolate

1.2.2 雙酶水解豌豆蛋白制備抗氧化肽

通過上述實驗選出1398 中性蛋白酶和胰蛋白酶對豌豆蛋白按照上述方法分步進行酶解生成豌豆蛋白水解產物(PPH)，測其對DPPH 清除能力。選用SuperdexTMpeptide 10/300 GL 預裝柱在AKTA 蛋白質分析純化系統對PPH 相對分子量分布進行考察。洗脫液為雙蒸水，流速為1 mL/min，上樣量50 μl。以細胞色素c(Mr 12384 Da)、抑肽酶(Mr 6512 Da)、維生素B12(Mr 1355 Da)、二甘氨酰甘氨酸(Mr 189 Da)、甘氨酸(Mr 75 Da)為標準品做標準曲線，以洗脫體積為橫坐標，相對分子量的對數為縱坐標。

1.2.3 豌豆抗氧化肽的純化

選出抗氧化性高的一組分在AKTA 蛋白質分析純化儀上進行反相色譜純化，樣品溶解于含有0.05% (v/v)三氟乙酸(TFA)的水溶液中，選用RESOURCETM3RPC 色譜柱，進樣量為1 mL，以2 mL/min 的流速用溶液A(5%乙腈，0.05%TFA)進行洗脫，檢測波長為215 nm，使用自動收集器收集洗脫峰。10 min 后，以流速為3 mL/min 進行梯度洗脫，15 min 后達到100%溶液B (60%乙腈，0.05%TFA)，每管5 mL 進行收集。富集的樣品進行旋轉蒸發、冷凍干燥后測各組分的DPPH 清除能力。

選出DPPH 清除率高的組分再一次進行反相層析，溶液A 為:10%乙腈，0.05%TFA;溶液B 為:5%乙腈，0.05%TFA，其他條件保持不變。按峰收集樣品，旋轉蒸發、冷凍干燥成粉末，檢測各峰的DPPH清除能力。在相同條件下選用SOURCETM5RPC ST 4.6/150 反相柱對各峰進行純度檢測。

1.3 分析方法

1.3.1 蛋白濃度測定

福林酚法［6］。

1.3.2 水解度( DH) 測定

根據pH-stat 法。DH% =VNaOH×CNaOH×1/α ×Mp×1/htot×100%

其中:VNaOH——水解過程中消耗NaOH 體積(mL)

CNaOH——NaOH 的濃度(mol/L)

α——α－氨基的解離度

Mp——底物中蛋白質總量(g)

htot——底物蛋白質中肽鍵總數(mmol/g)，其中肽鍵總數=［SUM(氨基酸質量/分子量)］/蛋白質總量，經計算豌豆蛋白htot 為7.55 mmol/g 。

1.3.3 DPPH 清除能力測定

取處于中性條件下一定濃度的樣品2 mL 加入到2 mL 0.2 mmol/L 的DPPH 甲醇溶液，振蕩均勻。置于黑暗環境下反應20 min，于517 nm 處測定上清液的吸光值(As)。以水代替樣品溶液做對照(Ac)。以2 mL 甲醇加入2 mL 水做空白調零。

酶解液樣品的DPPH 清除能力用清除率(%)表示，公式為［(Ac-As)/Ac］ ×100。

IC50值定義為對DPPH 自由基清除率達到50%時所需要的樣品濃度。

采用鄰苯三酚自氧法［7］。取1.5 mL 含有1 mM EDTA 的50 mmol/L 的Tris-HCl 緩沖液(pH 8.3)和0.5 mL 樣品溶液加入比色管中混勻，加入1 mL 用10 mM 鹽酸溶解的3 mM 鄰苯三酚，迅速混勻，在420 nm 處每隔30 s 測一次吸光度，3 min 后結束，以時間對吸光度做回歸方程，其斜率即為超氧自由基生成的速度，記為(△A/min s)。以水代替樣品溶液做對照(△A/min c)。以1.5 mL 水加入1.5 mL的Tris-HCl 緩沖液做空白調零。用GSH 做為參照。

酶解液樣品清除超氧陰自由基的能力用清除率(%)表示，公式為［(△A/min s-△A/min c)/ △A/min s］ ×100。

1.3.5 羥自由基( ·OH) 清除能力測定

采用鄰氮二菲法［7］。取0.5 mL 樣品加入1 mL 0.15 M 磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)，接著加入0.5 mL用緩沖液溶解的1.8 mM 鄰二氮菲溶液和0.5 mL 1.8 mM FeSO4水溶液，迅速混勻，最后加入0.5 mL 0.02%(V/V)的H2O2，在37 ℃下水浴60 min，于536 nm 下測其吸光值(As)。用水代替樣品作為對照(Ac)。用水代替樣品和H2O2作為空白(Ab)。以1.5 mL 磷酸鹽緩沖液加入1.5 mL 的水調零。用GSH 做為參照。

酶解液樣品清除羥自由基的能力用清除率(%)表示，公式為［(As-Ac)/(Ab-Ac)］ ×100。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶種類的確定

pH-stat 法是根據在酶解過程中加入的維持水解液pH 穩定的堿量來計算出水解度，它具有連續測定和了解不同時間下酶解情況的特點。由圖1 可以看出在反應初期水解度快速上升，說明酶解反應很迅速，隨著反應時間的增加，反應越來越緩慢，當進行到3 h 時，幾乎不增加，為了徹底酶解最終確定完全反應時間為4 h。反應完成后可以看到使用胰蛋白酶水解豌豆蛋白時水解度最大，這可能是由于豌豆蛋白中高含量的精氨酸(8. 7%)和賴氨酸(7.1%)正好是胰蛋白酶的作用位點。此外據文獻報道［8］，植物蛋白在堿性條件下更有利于被蛋白酶的水解。

圖1 使用4 種蛋白酶水解豌豆蛋白過程中水解度變化值Fig.1 Degree of hydrolysis (DH)during hydrolysis of pea protein isolate by various protases

DPPH 是一種人工合成的，具有單電子的，在醇溶液中很穩定的呈現紫色的氮中心的自由基，在517 nm 處有很強的吸光。當有清除自由基的物質存在時，DPPH 自由基能接受一個電子或者氫原子與自身的孤電子配對形成穩定的化合物，使紫色消失，可用分光光度計快速定量分析。由于穩定性、快速性、方便性被廣泛用于評定物質的抗氧化能力，因此選用DPPH 清除率為指標測定不同酶解產物的抗氧化能力。

為消除pH 高低對檢測DPPH 清除率的影響，使酶解液都調至中性。將不同水解產物離心所得上清液在不同濃度下測清除DPPH 的能力，以GSH 做參照，結果如圖2 所示，使用ORIGIN 軟件經非線性擬合計算出IC50值。結果顯示胰蛋白酶水解產物對DPPH 清除率最高，其次為中性蛋白酶，因此選用中性蛋白酶和胰蛋白酶對豌豆蛋白進行雙酶酶解。

圖2 不同水解液和GSH 對DPPH 的清除率Fig.2 DPPH scavenging activity of hydrolysates and GSH

2.2 雙酶水解產物中豌豆蛋白肽的分析

豌豆蛋白經雙酶水解所得產物PPH 與豌豆蛋白水溶液選用SuperdexTMpeptide 10/300 GL 層析柱比較相對分子量分布情況，用標準品確定相對分子量標準曲線得到的回歸方程為Y=5.66671-0.15565 X，R2=0.99262，分析出PPH 與豌豆蛋白水溶液的相對分子量分布范圍，如圖3、4 所示。選用該柱能夠很好的分離分子量在100～7000 Da 的多肽。在未進行水解的豌豆蛋白原液的分子篩圖譜中，可以看出主峰出現在大約位于8 mL 的外水體積處，基本上為大于10 KDa 的蛋白，占總蛋白的86.24%。而在PPH 的凝膠譜圖中，大部分洗脫峰是在洗脫體積10 mL 后才出現，小于2 KDa 的肽占主要部分，占總蛋白的77.07%。另一方面，對比圖譜可以觀察出，豌豆蛋白原液各峰的總面積小于各種酶解液的總峰面積，這是由于在中性條件下，只有很少的可溶性豌豆蛋白溶解在水中，當使用蛋白酶酶解豌豆蛋白時，蛋白酶作用于不可溶解的豌豆蛋白，使其變成可溶解的多肽，C.-H. Tang et al.［9］使用Sephadex G-50對大麻蛋白酶解產物分析也得出了相同結果。分析PPH 在不同濃度下清除DPPH 自由基的能力，如圖2 顯示，計算出IC50值為3.01 mg/mL，而在單酶水解產物中，對DPPH 清除能力最高的胰蛋白酶水解產物的IC50值為8.3 mg/mL，可以看出雙酶酶解產物明顯優于單酶酶解產物的抗氧化能力。

圖3 PPH 的Superdex Peptide 10/300 GL 凝膠色譜圖Fig.3 Elution profiles of PPH，using Superdex Peptide 10/300 GL gel

圖4 豌豆分離蛋白水溶液的Superdex Peptide 10/300 GL凝膠色譜圖Fig.4 Elution profiles of Pea protein isolate solution，using Superdex Peptide 10/300 GL gel

2.3 豌豆抗氧化肽的純化

圖5 凝膠色譜G-25 分離PPH 的層析圖Fig.5 Elution profile of PPH separated by Sephadex G-25 gel

圖6 不同組分對自由基的清除能力Fig.6 Free radicals scavenging effects of fractionated PPH

反相色譜(reversed phase chromatography，RPC)分離是基于溶質分子與固定相之間的疏水作用進行的，溶質中不同分子由于疏水性強弱的差異與固定相之間作用力就不相同，在洗脫的過程中按照疏水作用力由弱到強的順序進行分離。圖7 是對F2 組分進行反相層析后得到的洗脫圖，對洗脫液進行收集得到了一個得到5 個組分(F2-1 至F2-5)，F2-5 是被最后洗脫下來與反相柱結合最牢固的組分，因此與其他組分相比，它的疏水作用最強。重復上樣富集各組分進行旋轉蒸發去除乙腈、冷凍干燥后分析各組分對DPPH 的清除能力如圖8 所示，可以看出在相同濃度下，各組分對DPPH 的清除率逐步增加，Pownall et al.［4］使用反相層析分離蛋白酶解液測DPPH 清除率也得到了相似的結果。組分F2-5 分離得到的抗氧化肽在濃度為0.2 mg/mL 下對DPPH清除率到達了51.31%，遠高于相同濃度下PPH 對其清除的能力(15.92%)。

圖7 RESOURCETM 3RPC 反相層析分離F2 組分洗脫圖Fig.7 Purification of fraction F2 using RESOURCETM 3RPC reverse phase chromatography

圖8 不同組分和PPH 對DPPH 自由基的清除能力Fig.8 DPPH scavenging activity of fractions and PPH

對具有高DPPH 清除率的F2-5 組份再一次使用相同的反相層析柱進行純化分離，在加大乙腈濃度進行梯度洗脫時，得到了3 個峰(F2-5-1、F2-5-2、F2-5-3)，結果如圖9 所示，按峰收集洗脫液，重復上樣收集，樣品經旋蒸、干燥后測DPPH 清除能力，圖8 顯示在相同的濃度下，F2-5-2 具有最高的DPPH清除能力，濃度在0.2 mg /mL 時，對DPPH 的清除率達到62.03%，與的GSH 對DPPH 的清除率相近。用SOURCETM5RPC ST 4.6/150 反相柱對F2-5-2 峰進行純度，圖10 結果表明PPH 經Sephadex G-25 凝膠層析和兩次RESOURCETM3RPC 反相層析純化能獲得相對較高純度的高抗氧化活性肽。該多肽經MALDI-TOF-MS 質譜分析基本確定是分子量為956.5 Da 的一種八肽。

3 結論

豌豆分離蛋白經過1398 中性蛋白酶和胰蛋白酶分步酶解得到的產物PPH 抗氧化能力明顯高于單酶水解產物，證明了利用雙酶法能夠得到活性較高的豌豆抗氧化肽。豌豆抗氧化肽可用做純天然的功能性食品添加劑，它可為豌豆蛋白資源的開發提供新思路。

由于酶解產物中多肽組分復雜，需要利用分離技術手段進行純化以獲得抗氧化性目標組分，PPH通過了凝膠層析和反相層析分離純化獲得相對較高純度的高抗氧化活性肽，當濃度在0.2 mg /mL 時，對DPPH 自由基的清除率達到62.03%，接近于同濃度下生物體內存在的抗氧化肽GSH 對DPPH 的清除能力。為探究多肽的結構、氨基酸組成等與活性之間的關系，隨后將會對所獲得的活性組分繼續進行更深入的分析鑒定。

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