高粱原花青素四聚體干預Streptococcus mutans Ingbritt（c）體外黏附途徑及機理

黃 曼，蔡 欣，玉佳男，唐翠娥，劉 睿*

（華中農業大學食品科學技術學院，環境食品學教育部重點實驗室，湖北 武漢 430070）

高粱原花青素四聚體干預Streptococcus mutans Ingbritt（c）體外黏附途徑及機理

黃 曼，蔡 欣，玉佳男，唐翠娥，劉 睿*

（華中農業大學食品科學技術學院，環境食品學教育部重點實驗室，湖北 武漢 430070）

以高純度高粱原花青素（sorghum procyanidins，SPC）混合物和高粱原花青素四聚體（sorghum procyanidins tetramers，SPC-Ⅲ）為原料，采用熒光標記的方法比較其抑制Streptococcus mutans Ingbritt（c）黏附效果，在此基礎上結合雙向凝膠電泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）以及基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix-associated laser dissociation/ionization time of fl ight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）探究其干預S. mutans Ingbritt（c）黏附的主要途徑并期望闡明其作用機理。結果表明：SPC-Ⅲ比SPC混合物抑制S. mutans Ingbritt（c）體外黏附的效果更強，SPC-Ⅲ處理細菌的抑制效果強于處理獲得性膜的抑制效果，是其抑制細菌黏附主要途徑；類葡萄糖基轉移酶（glycosyltransferases，GTFs）活性蛋白（3.10-Ⅱ）經SPC-Ⅲ作用前后的2-DE圖有明顯差異，差異點均為S. mutans中的不同蛋白酶類，其中A24可能是一種新蛋白。

高粱原花青素；黏附；熒光標記；雙向凝膠電泳；基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜

齲病為最常見的口腔感染性疾病，主要發生于牙齒硬組織，其患病率高、危害范圍廣，90%學齡兒童及成年人均不同程度受到齲病的影響。變形鏈球菌（Streptococcus mutans）作為主要口腔致病菌，其中多樣化的毒力因子是其致齲的物質基礎，尤其是葡萄糖基轉移酶（glycosyltransferases，GTFs）合成的水不溶性多糖，參與介導S.mutans蔗糖依賴性黏附，是齲病發生的始動條件[1-2]。在國內外學者進行的防齲研究中，天然藥物因其安全、經濟，并能調理口腔菌群平衡而受到眾多學者的青睞。目前認為天然植物中有效的防齲成分主要有鞣質、黃酮類化合物、木脂素和多酚類物質等。大量研究表明從多種植物（如越橘汁、烏龍茶、葡萄柚、葡萄等）中分離出的多酚物質對S. mutans中葡聚糖的形成、GTFs的活性等均表現出很強的抑制能力，從而阻礙了S. mutans的蔗糖依賴性黏附[3-6]。原花青素屬于多酚類物質，它的藥理活性受其單體組成、構型以及聚合度等多種因素的影響[7]。

現有研究多采用體外模擬S. mutans在唾液包被羥基磷灰石（saliva-cuated hydroxylapatite，SHA）上的黏附效果，探究天然產物成分抑制致齲菌的黏附情況[8-10]，揭示其抑制能力。研究結果顯示同濃度的綠茶提取物（sunphenon）和茶多酚處理細菌的黏附抑制率明顯高于處理獲得性膜的黏附抑制率[6]，在一定程度上揭示了天然活性多酚抑制S. mutans體外黏附的主要途徑。由于S. mutans是黏附于唾液在牙齒表面形成的獲得性膜上，實驗藥物或天然活性成分有多種抑制途徑，導致實驗當中的可變因素多，且目前的研究多采用粗提物或混合物進行，鮮有以組成或結構明確的活性成分為原料，并探求其抑制S. mutans體外黏附主要途徑的報道。

大量研究事實證明植物多酚對S. mutans的生物活性有明顯影響，若要進一步探討其抑制機理需找出S. mutans中能與多酚發生作用的受體物質，因此植物多酚對變形鏈球菌表面黏結素，尤其是對GTFs抑制效果的研究成為主要研究對象。通過測定GTFs經過多酚處理前后性質的改變（如GTFs酶活性）即可判定多酚抑制GTFs活性影響S. mutans的黏附[11-13]，在一定程度上揭示了多酚可通過產生對GTFs的影響從而抑制S. mutans的黏附。若要進一步探求多酚與GTFs的內在作用機理，需要從分子層面上進行。隨著蛋白質組學的發展，雙向凝膠電泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）以及基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix-associated laser dissociation/ionization time of fl ight mass spectrometry，MALDITOF-MS）也成為生物研究的主流技術，被學者們廣泛用于分析細菌蛋白的差異性表達以及活性小分子與蛋白質大分子相互作用的研究。但未見將2-DE和MALDI-TOF-MS相結合運用于探究多酚和S. mutans黏結蛋白的相互作用。

因此，本研究以高純度高粱原花青素 （sorghum procyanidins，SPC）混合物和高粱原花青素四聚體（sorghum procyanidins tetramers，SPC-Ⅲ）（ESI-MS/MS分析其為原花青素四聚體）為原料，采用熒光標記方法模擬體外黏附SHA模型篩選高活性抑制S. mutans黏附的原花青素活性成分，并分別處理細菌和獲得性膜探究其干預S. mutans體外黏附的主要作用途徑，在此基礎上，結合2-DE和MALDI-TOF-MS分析探討SPC-Ⅲ與S. mutans主要毒力因子GTFs的作用機理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羥基磷灰石（hydroxylapatite，HA），四川空腔醫學院提供；唾液，20～25歲口腔健康的志愿者提供，低溫冷凍保存；S. mutans Ingbritt（c），由武漢大學口腔醫學部提供，－80 ℃甘油低溫保存；高純度SPC混合物（Porter’s法測得純度大于98%）、SPC-Ⅲ[14]（ESI-MS/MS分析其為原花青素四聚體）、類GTFs蛋白3.10-Ⅱ，實驗室前期制備[7]。

熒光染料BECEF/AM 碧云天生物技術研究所。

1.2 儀器與設備

RF-5301pc熒光分光光度計 日本島津公司；ABI4700 MALDI-TOF-TOF質譜儀 美國ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 Tryptic Soy Broth（TSB）培養基[8]、標準菌液及活性成分溶液的制備

標準菌液：將復蘇48 h后的S. mutans Ingbritt（c）接種于TSB液體培養基中，37 ℃條件下厭氧培養18～24 h，涂片檢查為純培養后，離心（3000 ×g，10 min）收集菌體，磷酸鹽緩沖液洗滌2次，重新懸浮于磷酸鹽緩沖液中，調節菌濃度至OD600nm=1.10，備用。

活性成分溶液：將NaF、SPC混合物和SPC-Ⅲ用0.01 mol磷酸鹽緩沖液配制成下列質量濃度梯度：7.812 5、15.625、31.25、62.5、125.0、250.0、500.0 μg/mL，備用。

1.3.2 活性成分分別處理S. mutans Ingbritt（c）或獲得性膜干預其在SHA上黏附的效果

實驗步驟分別見圖1、2，每組4份，將磷酸鹽緩沖液代替藥液的孔作為陰性對照組，測得的熒光值作為總熒光值。采用熒光分光光度計測定熒光強度（激發波長488 nm，發射波長535 nm）。按下式計算細菌黏附抑制率。

圖1 活性成分處理S. mutans Ingbritt（c）后對其在SHA黏附的影響研究流程圖Fig.1 Flow chart of the effect of bioactive constituent treatments on the S. mutans Ingbritt (c) adhesion to SHA

圖2 活性成分處理獲得性膜對S. mutans Ingbritt（c）在SHA上黏附的影響研究流程圖Fig.2 Flow chart for studying the effect of bioactive constituents-treated salivary acquired pellicle on S. mutans Ingbritt (c) adhesion to SHA

1.3.3 SPC-Ⅲ與類GTFs活性蛋白3.10-Ⅱ的雙向電泳分析

準確配制質量濃度為30 mg/mL的3.10-Ⅱ蛋白溶液和質量濃度為5 mg/mL的SPC-Ⅲ溶液。吸取1 mL 3.10-Ⅱ蛋白溶液凍干得到反應前蛋白粉末。再分別吸取1 mL 3.10-Ⅱ蛋白溶液和1 mL SPC-Ⅲ溶液混合，反應5 min后，4℃、10 000×g離心10 min，將上清液凍干，得到反應后蛋白粉末。將得到的兩個蛋白粉末進行雙向電泳分析。

1.3.4 SPC-Ⅲ與類GTFs活性蛋白3.10-Ⅱ反應前后差異點的MALDI-TOF-MS分析

凝膠顯色后經掃描和圖像分析，比較與SPC-Ⅲ反應前后的3.10-Ⅱ蛋白的2-DE膠圖，得到差異蛋白點。將差異點進行順序編號，利用美國ABI4700 MALDI-TOF-MS質譜儀進行分析并輸入數據庫檢索。

1.4 數據處理

采用SPSS11.5統計軟件，選用單因素方差分析的Dunnett雙側檢驗，比較各實驗組與對照組之間熒光強度的統計學差異。

2 結果與分析

2.1 活性成分分別處理S. mutans Ingbritt（c）或獲得性膜干預其在SHA上黏附的效果

設置NaF為陽性對照，SPC混合物和SPC-Ⅲ 3種活性成分先處理S. mutans Ingbritt（c），菌被熒光標記后再黏附于形成了獲得性膜的SHA上，通過檢測熒光強度計算其黏附抑制率。

由表1可知，隨著活性成分質量濃度的升高，熒光強度逐漸減弱，隨著質量濃度的上升，≥62.5 μg/mL時，各活性成分的每個質量濃度與對照組比較均有極顯著差異（P＜0.01），并且SPC-Ⅲ的熒光強度明顯最低，提示S. mutans Ingbritt（c）經過SPC-Ⅲ處理后在SHA上黏附最少。由圖3可知，隨著3種活性成分質量濃度的升高，它們對S. mutans Ingbritt（c）在SHA上的黏附抑制率呈上升趨勢；最高質量濃度時，SPC-Ⅲ的抑制率為67.76%明顯高于另外兩種成分綜上所述，可推測SPC-Ⅲ處理S. mutans Ingbritt（c）后干預其在SHA上的黏附能力最強。

表1 不同活性成分處理S. mutans Ingbritt（c）干預其在SHA上黏附的熒光強度Table 1 Fluorescence intensity of S. mutans Ingbritt (c) adhesion to SHA during intervention with different bioactive constituents

圖3 不同活性成分處理S. mutans Ingbritt（c）干預其在SHA上黏附抑制率變化Fig.3 Inhibitory change of S. mutans Ingbritt (c) adhesion to SHA during intervention with different bioactive constituents treatments

表2 不同活性成分處理獲得性膜后干預S. mutans Ingbritt（c）在SHA上黏附的熒光強度Table 2 Fluorescence intensity of S. mutans Ingbritt (c) adhesion to SHA during intervention with salivary acquired pellicle treated by different bioactive constituents

由表2可知，當3種活性成分處理獲得性膜時，隨著質量濃度的升高，熒光強度逐漸減弱，SPC-Ⅲ在較高的3個質量濃度（＞62.5 μg/mL）的熒光強度與對照組比較有極顯著性差異（P＜0.01），陽性對照NaF只有在質量濃度125.0 μg/mL處的熒光強度與對照組比較才有顯著性差異（P＜0.05）。由圖4可知，隨著3種成分質量濃度升高，對S. mutans Ingbritt（c）在SHA上的黏附抑制率呈先上升較快后平緩的趨勢。最高質量濃度時，3種成分的抑制率均低于35%，但是SPC-Ⅲ對菌在SHA表面黏附的抑制率仍然表現最高。綜上所述，可推測活性成分處理獲得性膜后干預S. mutans Ingbritt（c）在SHA上的黏附效果較弱，但SPC-Ⅲ抑制黏附能力仍然比其他活性成分效果明顯。

圖4 不同活性成分處理獲得性膜干預S. mutans Ingbritt（c）在SHA上黏附抑制率變化Fig.4 Inhibitory change of S. mutans Ingbritt (c) adhesion to SHA during intervention with salivary acquired pellicle treated by different bioactive constituents

根據上述結果有如下推測：活性成分處理S. mutans Ingbritt（c）比處理獲得性膜干預菌在SHA上黏附的抑制能力強，且SPC-Ⅲ的抑制能力表現為最強。此結果與Otake等[15]和肖悅等[20]研究結果相似，兩位學者同樣采用唾液包被HA形成實驗性膜的體外模式，研究結果表明，同質量濃度的實驗活性成分處理致齲菌后對其黏附抑制率高于先處理獲得性膜后對菌黏附抑制率。

以上結果顯示活性物質處理齲齒菌抑制其黏附的效果明顯好于處理獲得性膜的效果。這可能是因為S. mutans的表面蛋白（黏附受體）結構中有一段富含脯氨酸并跨越細胞壁的肽段[16]，多酚物質能與富含脯氨酸的蛋白形成穩定復雜的化合物，從而干擾細胞表面受體參與黏結。以前的實驗多采用含有單寧等多種多酚類物質的粗提物進行實驗，無法明確產生作用的具體成分[15]，而本實驗采用純度高且組成成分明確的四聚體進行檢測，最大程度降低了干擾現象。在唾液包被羥磷灰石的體外黏附模式中，生物膜對抗菌藥物的耐受性，其中細菌的組成以及對環境的適應性等在其形成過程的不同階段均會發生變化[17]。與浮游細菌相比，牙菌斑生物膜對于藥物的敏感性因其特殊的結構和生理特性而降低[18]。研究表明茶多酚可改變獲得性膜表面的性質，從而減少細菌對茶多酚處理過的SHA的黏附：首先，茶多酚能與唾液獲得性膜中的富脯蛋白形成穩定的化合物，改變其構型，抑制其活性，阻礙細菌與獲得性膜上的受體結合，減少細菌的黏附。其次，由于富脯蛋白和唾液淀粉酶是S. mutans在唾液獲得性膜中的受體，多種茶多酚均能抑制唾液淀粉酶活性[19]，由此推測，本研究中S. mutans Ingbritt（c）和獲得性膜經3種活性成分處理后，其中某些具有黏附功能的因子減少或是構象、功能發生改變，致使細菌在SHA上黏附的減少。當成分質量濃度相同時，兩種處理方式導致黏附抑制率出現差別，處理細菌的黏附抑制率高于處理獲得性膜的黏附抑制率，可推測活性成分作用于細菌是抑制致齲菌黏附的主要作用途徑。

2.2 2-DE和MALDI-TOF-MS分析與SPC-Ⅲ作用前后的類GTFs活性蛋白3.10-Ⅱ

圖5 類GTFs活性蛋白3.10-Ⅱ的雙向電泳圖Fig.5 2-DE of 3.10-Ⅱ

圖6 SPC-Ⅲ處理類GTFs活性蛋白3.10-Ⅱ的雙向電泳圖Fig.6 2-DE of 3.10-Ⅱ treated by SPC-Ⅲ

實驗前期分離得到S. mutans Ingbritt（c）中的主要黏結蛋白——GTFs粗提物，在此基礎上通過凝膠進一步純化和分離獲得類GTFs活性蛋白3.10-Ⅱ，將其作為研究目標蛋白。采用2-DE對作用前后的3.10-Ⅱ蛋白進行分析，以便更直觀深入地探究兩者作用前后3.10-Ⅱ蛋白的變化。雙向電泳圖分別見圖5、6。經軟件分析后將與SPC-Ⅲ作用前后灰度值明顯降低的點分別編為A01～A51。其中灰度值最大的6個點分別為：A02、A08、A24、A26、A41和A51，證明它們是類GTFs活性蛋白3.10-Ⅱ與SPC-Ⅲ作用前后差異最大的點。

表3 雙向電泳A24和A51蛋白點通過MALDI-TOF-MS分析和數據庫檢索得到的蛋白成分Table 3 Protein composition of A24 and A51 electrophoresis spot in two-dimensional electrophoresis

經數據庫檢索，選取點的MALDI-TOF-MS分析結果顯示，以上6個點的蛋白均為S. mutans家族中所含有的具有不同功能的蛋白酶類。A24和A51蛋白點通過MALDITOF-MS分析和數據庫檢索得到的蛋白成分信息如表3所示。A51為二甲基腺苷轉移酶。A24蛋白點信息未收錄在S. mutans細菌庫中，但在整個細菌庫中檢索出，為外膜蛋白1，是一種孔蛋白，主要存在于細胞膜上，可推測該蛋白是一種同源蛋白存在于多數菌中，也可能是以前未在S. mutans中檢測出的一種新蛋白。

3 結 論

以NaF為陽性對照，熒光檢測SPC混合物、SPC-Ⅲ分別處理S. mutans Ingbritt（c）和獲得性膜干預其在SHA上的黏附，結果表明：3種研究材料均表現出對S. mutans Ingbritt（c）黏附于SHA的抑制作用，存在明顯的濃度效應關系，其中SPC-Ⅲ的抑制效果明顯優于NaF和SPC混合物；并且其處理細菌是干預體外黏附的主要途徑。

從GTFs粗提物中分離得到的類GTFs活性蛋白（3.10-Ⅱ）與SPC-Ⅲ作用前后的2-DE圖顯示有多個蛋白點均發生不同程度的顏色變化，灰度值變化相對大的蛋白點經MALDI-TOF-MS分析后，檢索得到所有點均為變形鏈球菌家族中的不同蛋白酶類，其中A24為外膜蛋白，在全細菌庫中檢索出，推測該蛋白可能是一種同源蛋白或是以前未在變形鏈球菌中檢測出的一種新蛋白。

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in vitro Adhesion Pathways and Mechanisms of Streptococcus mutans Ingbritt (c) during Intervention with Proanthocyanidins Tetramers

HUANG Man, CAI Xin, YU Jia-nan, TANG Cui-e, LIU Rui*
(Key Laboratory of Environment Correlative Dietology, Ministry of Education, College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

In this study, high purity proanthocyanidins (SPC) and proanthocyanidins tetramers (SPC-III) from sorghum episperm were compared for their inhibitory effects on the adhesion of Streptococcus mutans Ingbritt (c) through fluorescence labeling. By combining two-dimensional electrophoresis (2-DE) and matrix-associated laser dissociation/ ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS), the major intervening pathways were investigated, and the underlying mechanisms were explored. The results showed that SPC-III (tetramers) had better inhibitory effect than SPC and had stronger inhibitory effect than SPC-III-treated salivary acquired pellicle on the adhesion of S. mutans Ingbritt (c), which was the major pathway to inhibit bacterial adhesion. Two-dimensional electrophoretograms of 3.10-II treated by SPC-III or not showed significant differences. All different points were different proteases derived from S. mutans, in which A24 was suggested to be a new protein that has never been detected in S. mutans previously.

sorghum proanthocyanidins; adhesion; fluorescence labeling; two-dimensional electrophoresis; matrixassociated laser dissociation/ionization time of fl ight mass spectrometry

TS201.9

A

1002-6630（2014）03-0001-05

10.7506/spkx1002-6630-201403001

2013-07-19

國家自然科學基金項目（31271939）

黃曼（1988—），女，碩士研究生，研究方向為天然產物化學與功能食品。E-mail：huangman_880103@163.com

*通信作者：劉睿（1969—），男，副教授，博士，研究方向為天然產物化學與功能食品。E-mail：liurui@mail.hzau.edu.cn