山楂果膠的抗氧化活性

董銀萍，李拖平*

（1.遼寧大學生命科學院，遼寧 沈陽 110036；2.遼寧大學食品科學系，遼寧 沈陽 110036）

山楂果膠的抗氧化活性

董銀萍1,2，李拖平2,*

（1.遼寧大學生命科學院，遼寧 沈陽 110036；2.遼寧大學食品科學系，遼寧 沈陽 110036）

目的：研究山楂果膠的體內外抗氧化活性。方法：離體條件測定山楂果膠對O2-·、DPPH自由基和·OH的清除能力；利用高脂小鼠模型考察山楂果膠在生物體內的總抗氧化能力。結果：山楂果膠離體條件對O2-·、DPPH自由基和·OH表現出顯著的清除作用。山楂果膠能顯著提高小鼠肝臟谷胱甘肽（glutathione，GSH）的含量和抗氧化酶類谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）的活性，并可顯著降低小鼠肝臟丙二醛（malondialdehyde，MDA）的含量。結論：山楂果膠具有顯著的體內外抗氧化活性，在功能食品等領域具有良好的應用前景。

山楂果膠；抗氧化；脂質過氧化

山楂（Crataegus）屬薔薇科山楂屬，全世界約有280多個種[1]。在我國山楂是藥果兼用樹種，按地理位置、氣候特點和栽培利用等情況，大致可分為吉遼、京津冀、魯蘇、中原、云貴高原5個山楂產區。山楂中果膠含量達6.4%，居所有水果之首[2]。果膠是一種多聚半乳糖醛酸，相對分子質量約為50 000～300 000。果膠的獨特化學性質與化學構造[3]使其作為膠凝劑、增稠劑、穩定劑和乳化劑等，廣泛應用于食品和化妝品行業。此外，果膠還具有較好的抗腹瀉[4]、抗癌[5]、減肥降脂[6]作用，在醫藥領域用于防止有毒陽離子中毒，防止血液凝固以及治療便秘[7]。

正常情況下，生物體內處于氧化與抗氧化的動態平衡狀態，使組織免受損傷。機體受到損傷可使活性氧自由基增多，造成脂質過氧化反應的發生[8]。GSH可通過供H+拮抗氧自由基毒性，終止自由基連鎖反應，其本身則被GSH-Px氧化成GSSG，同時促進H2O2的分解，保護細胞膜的結構及功能不受過氧化物的干擾及損害，從而起到抗氧化保護肝臟的作用[9-10]。CAT同樣可以催化H2O2分解成氧和水，存在于所有已知動物的組織細胞過氧化物體內[11]，特別在肝臟中以高濃度存在。SOD是生物體內重要的抗氧化酶，能有效清除超氧陰離子自由基，抑制脂質的過氧化物作用[12]。GSH-Px、SOD和CAT一起共同構成生物體內的活性氧防御系統。

有研究表明蘋果果膠具有較強的活性氧消除能力[13]。一種來源于大葉海草（Seagrass Zostera marina）的果膠可以降低小鼠肝臟的過氧化產物丙二醛的水平[14]。但有關山楂果膠抗氧化活性的研究還未見報道。本實驗就山楂果膠的體內外抗氧化活性進行研究，以期為山楂果實深加工利用提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山楂果實，采自沈陽市近郊；動物飼料 北京華阜康生物科技股份有限公司。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl) hydrazyl，DPPH） 阿法埃莎（天津）化學有限公司；氯化硝基四氮唑藍（nitrotetrazolium blue chloride，NBT） 國藥集團化學試劑有限公司；GSH測定試劑盒、GSH-Px活性測定試劑盒、SOD活性測定試劑盒、CAT活性測定試劑盒、MDA含量測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；其他試劑均為分析純。

1.2 動物

雄性昆明種小鼠60只，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供；小鼠的飼養環境保持室溫（22±1）℃，相對濕度50%～60%，自然采光。適應性喂養1周后開始進食受試物。

1.3 儀器與設備

CP114電子天平 奧豪斯（中國）有限公司；722N可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；TGL-16M高速臺式冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；DW-FL270超低溫冰箱 中科美菱低溫科技有限責任公司。

1.4 方法

1.4.1 山楂果膠的制備

參照王娜等[15]的方法，以熱水直接攪拌法提取可溶性果膠。即將干燥的山楂粉末用氯仿-甲醇溶液（1∶1，V/V，70℃加熱環流），再用乙醚進行脫脂脫色處理數次，直到溶液的紅色全部消失為止，后進行干燥。經脫脂后的山楂果粉加入20倍體積的熱蒸餾水（95 ℃）充分攪拌提取4 h，提取液經離心（4 000 r/min）后回收上清液。將提取液濃縮，邊攪拌邊加入2倍體積的95%乙醇，室溫下靜置4 h，離心，回收沉淀。所得沉淀再加入70%乙醇漂洗數次，回收沉淀經無水乙醇進一步脫水、離心丙酮洗脫、抽濾、濾渣干燥即得白色熱水可溶性果膠。用苯酚-硫酸法[16]測得其總糖含量為92.2%，用咔唑比色法[17]測得其半乳糖醛酸含量為70.4%。

1.4.2 動物喂養與取樣

實驗隨機分為5組，每組12只，分別為空白組、高脂對照組和低（50 mg/kg）、中（150 mg/kg）、高（300 mg/kg）3個劑量山楂果膠組?？瞻捉M給予普通飼料，其余各組均給予高脂飼料，小鼠自由飲食飲水。低、中、高3個劑量山楂果膠組每天灌胃山楂果膠，空白組和高脂對照組灌胃等量蒸餾水。實驗于10周后結束，小鼠提前24 h禁食不禁水，斷頸椎處死，迅速解剖取出所需臟器，用預冷生理鹽水洗去血漬、濾紙吸干，液氮速凍，置－80 ℃冰箱保存。

1.4.3 山楂果膠離體抗氧化能力的測定

1.4.3.1 山楂果膠對O2-·清除能力的測定

參照楊寧等[18]的方法，向干燥的試管內依次加入0.5 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.8）、0.13 mol/L蛋氨酸、2.0×10-5mol/L核黃素、7.0×10-4mol/L NBT、不同質量濃度（0.1、1、10 mg/mL）的待測樣品各0.4 mL和蒸餾水1.0 mL，混合均勻。以未加蛋氨酸和樣品溶液的體系為空白，以未加樣品液的體系為對照。將混合液在35 ℃、4 000 lx光照下還原20 min后以黑暗終止反應，在560 nm波長處測定其吸光度。超氧自由基的清除率按式（1）進行計算。

1.4.3.2 山楂果膠對DPPH自由基清除能力的測定

按照杜麗娟等[19]的方法，吸取不同濃度的待測樣品0.5 mL，加入2.0 mL 0.2 mmol/L的DPPH-乙醇(60%)溶液中，混合均勻，靜置30 min后在517 nm波長處測定其吸光度（A樣品）。以相同比例的待測樣品與60%乙醇的混合溶液為對照（A對照）、以DPPH溶液與60%乙醇的混合液為空白（A空白）。DPPH自由基的清除率按式（2）進行計算。

1.4.3.3 山楂果膠對·OH清除能力的測定

參考顏軍等[20]的方法，分別取不同質量濃度的待測樣品1 mL，1.8 mmol/L FeSO4溶液2 mL，1.8 mmol/L水楊酸-乙醇1.5 mL，最后加入H2O2（0.03%）0.1 mL啟動反應，振蕩混合均勻后在37 ℃保溫30 min，以蒸餾水代替樣品管為對照（A對照），在510 nm波長處測定其吸光度（A樣品）。羥自由基的清除率計算公式同式（1）。

1.4.4 山楂果膠體內抗氧化能力的測定

采用二硫代二硝基苯甲酸法測定GSH、還原型GSH消耗法測定GSH-Px活性、黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性、鉬酸銨法測定CAT活性、硫代巴比妥酸法測定MDA含量。操作過程嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.5 數據分析

2 結果與分析

2.1 山楂果膠離體條件下的抗氧化能力

圖1 山楂果膠對自由基的清除作用Fig.1 Free radical scavenging activities of haw pectin

由圖1a可知，山楂果膠對O2-·清除作用隨著質量濃度增加而增強。1 mg/mL山楂果膠對O2-·的清除作用達到30%，與低質量濃度（0.1 mg/mL）相比效果顯著（P＜0.01）；而當質量濃度達到10 mg/mL時，清除率為91%。由圖1b可知，與山楂果膠清除O2-·的趨勢相同，山楂果膠分解物在高質量濃度（10 mg/mL）條件下能表現出顯著的抗氧化活性（P＜0.01），而在低質量濃度（0.1 mg/mL）條件下作用并不明顯。由圖1c可知，山楂果膠對·OH具有明顯的清除作用，隨著樣品質量濃度的增加，清除率明顯升高，中質量濃度（1 mg/mL）、高質量濃度（10 mg/mL）與低質量濃度（0.1 mg/mL）相比效果極顯著（P＜0.01）。高質量濃度山楂果膠（10 mg/mL）對·OH的清除率為72%。

2.2 山楂果膠體內抗氧化能力

2.2.1 山楂果膠對小鼠肝臟GSH含量的影響

由圖2可知，高脂對照組小鼠肝臟GSH含量較空白組顯著下降。而與高脂對照組相比，山楂果膠3個劑量組的GSH含量均顯著增加，但各劑量之間差異并不明顯。山楂果膠能將小鼠肝臟內GSH含量提高至210 μg/g，具有有效的抗氧化作用。

圖2 山楂果膠對小鼠肝臟GSH含量的影響Fig.2 Effect of haw pectin on GSH content in the liver of mice

2.2.2 山楂果膠對小鼠肝臟抗氧化酶類活性的影響

圖3 山楂果膠對小鼠肝臟抗氧化酶類活性的影響Fig.3 Effect of haw pectin on antioxidant enzyme activities in the liver of mice

由圖3a可知，高脂對照組較空白組小鼠肝臟GSH-Px活性顯著下降。與上述小鼠肝臟GSH含量趨勢相類似，中劑量和高劑量山楂果膠組GSH-Px活性顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）。GSH-Px能催化GSH對氫過氧化物的還原反應，使機體免受過氧化物的損傷。由圖3b可知，高脂對照組小鼠肝臟CAT活性明顯下降；給予山楂果膠后，中劑量（150 mg/kg）山楂果膠組的CAT活性顯著提高（P＜0.01），但低劑量和高劑量山楂果膠組與高脂模型組相比差異并不顯著。由圖3c可知，小鼠肝臟SOD活性隨山楂果膠灌胃劑量的增加而增加。低、中劑量組SOD活性與高脂對照組相比無顯著性差異，而高劑量則顯著（P＜0.05）地提高了肝臟SOD活性。

2.2.3 山楂果膠對小鼠肝臟MDA含量的影響

圖4 山楂果膠對小鼠肝臟MDA含量的影響Fig.4 Effect of haw pectin on MDA content in the liver of mice

由圖4可知，高脂對照組小鼠肝臟MDA含量顯著高于空白組（P＜0.05）。山楂果膠3個劑量組均能顯著降低中小鼠肝臟MDA，特別是高劑量果膠組MDA含量低于對照組近50%。

3 討 論

自由基是游離存在的含有不配對電子的基團，它們在體內有很強的氧化反應能力，易對蛋白質、脂質和核酸等產生傷害，從而引起機體損傷[21]。有研究表明從蘋果渣中提取的蘋果果膠對DPPH自由基具有顯著的清除作用，其抑制作用在一定范圍內呈質量濃度依賴關系[22]。本實驗中，高質量濃度（10 mg/mL）的山楂果膠對O2-·、DPPH自由基和·OH這3種自由基均表現出顯著的清除效果，其清除率分別達到91%、84%和72%，表明山楂果膠具有較強的的抗氧化及清除自由基的活性功能。

脂質過氧化代謝產物如丙二醛，會引起蛋白質、核酸等生命大分子的交聯聚合，造成組織細胞膜結構的損傷，引起細胞功能失調甚至破裂、死亡，從而導致組織細胞功能的損傷[23]。當體內抗氧化能力增強，抗氧化酶活性增高時，可阻止脂質過氧化或降低脂質過氧化產物的含量。機體對活性氧O2-·的第一道防線是SOD，它將O2-·轉化為H2O2和其他氫過氧化物；第二道防線是CAT和GSH-Px，其中CAT可清除過氧體系中的H2O2，而GSH-Px分布在細胞的胞液和線粒體中，可同時清除H2O2和氫過氧化物，從而有效地保護機體[24]。本研究結果顯示，山楂果膠可以顯著的提高小鼠肝臟抗氧化酶系統GSH、GSH-Px、CAT和SOD的活性，說明山楂果膠抗氧化活性的機制之一是提高了抗氧化系統的酶活力；同時山楂果膠顯著增加了肝臟GSH含量。有研究表明，果膠可顯著降低大鼠血清丙二醛水平并且降低其體內的脂質過氧化水平[25]。本研究就山楂果膠對小鼠肝臟中過氧化產物MDA含量的研究也發現了相似的趨勢，證明山楂果膠不僅能有效調節小鼠肝臟抗氧化活性，而且表現出一定的劑量效應。

綜合本實驗結果推測山楂果膠可能是通過提高抗氧化酶活性，增加抗氧化活性物質GSH含量達到體內清除自由基的效果，進而起到增強生物體內抗氧化能力，抑制脂質過氧化的效果。本研究結果為以山楂為原料的食療保健食品的開發提供了有效的理論基礎與科學根據。此外，我國有著豐富的山楂資源，選用山楂為原料，對山楂果膠進行提取開發，無論是鑒于提高山楂的精深加工利用效率與經濟轉換價值，還是天然抗氧化劑市場的需求，都具有巨大的經濟效益和社會效益。

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Antioxidant Activity of Haw Pectin in vitro and in vivo

DONG Yin-ping1,2, LI Tuo-ping2,*
(1. College of Life Science, Liaoning University, Shenyang 110036, China; 2. Department of Food Science, Liaoning University, Shenyang 110036, China)

Objective: To explore the antioxidant activity of haw pectin in vitro and in vivo. Methods: The free radical scavenging activities of haw pectin on superoxide anion, DPPH and hydroxyl radicals were detected. The in vivo antioxidant activity was investigated in high-fat-diet-fed mouse model. Results: Haw pectin showed significant free radical scavenging activities against all the three radical species. It also significantly increased the content of glutathione (GSH) and the antioxidant enzyme activities of glutathione peroxidase (GSH-Px), superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT). Moreover, it significantly decreased malondialdehyde (MDA) content in the liver of mice. Conclusion: Haw pectin has great potential for the development of functional foods due to its excellent antioxidant activity.

haw pectin; antioxidation; lipid peroxidization

Q539.8

A

1002-6630（2014）03-0029-04

10.7506/spkx1002-6630-201403006

2013-04-20

國家自然科學基金面上項目（C200102/31071521）；遼寧省食品生物加工工程中心項目；沈陽市重點實驗室項目（F11-235-1-00）

董銀萍（1989—），女，碩士研究生，研究方向為食品營養學。E-mail：dyp513829091@gmail.com

*通信作者：李拖平（1967—），男，教授，博士，研究方向為食品化學與營養。E-mail：ltp0401@126.com