通心絡下調RAGE-MAPK信號通路拮抗AGEs 誘導的人內皮祖細胞內皮分化異常

武雙平，賀治青，袁國強，王永恒，梁 春

(1．河北以嶺醫院，石家莊 050091；2．第二軍醫大學附屬上海長征醫院，上海 200003)

內皮祖細胞(human endothelial progenitor cells, hEPCs)作為內源性血管修復的重要介導細胞[1, 2]，其作用和調控分化等生理特性一直是人們研究的熱點，從他汀類藥物的促hEPCs動員到在體捕獲hEPCs促進支架內再內皮化的新型支架系統的問世[3]，無不彰顯hEPCs在動脈粥樣硬化相關血管病變損傷后修復的重要作用，但在糖尿病等病理環境中hEPCs的功能和狀態發生改變。我們前期的研究證實，糖尿病的重要致病因素——晚期糖基化終產物(advanced glycation end products, AGEs)可通過激活RAGE-MAPK信號通路導致hEPCs功能異常，上述病理作用可部分被通心絡(tongxinluo, TXL)所阻斷。而現有大量研究證據提示，除了自身增殖、遷移和分泌功能，內皮分化是其hEPCs介導內源性血管修復的另一重要生理基礎[4]。因此，本研究旨在觀察TXL對AGEs誘導的hEPCs內皮分化異常的保護作用及其相關分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和材料

通心絡超微粉由石家莊以嶺藥業公司提供；淋巴細胞分離液、FITC標記荊豆凝集素(FITC-UEA-1)及MAPK信號通路激動劑購自美國Sigma公司；蛇皮透析膜、超濾管、Accutase酶和人纖連蛋白均購自美國Millipore公司；RAGE抗體、Taqman熒光探針、定量PCR試劑、胎牛血清和Dil標記的乙?；兔芏戎鞍?Dil-acLDL)購自美國Life公司；內毒素檢測鱟試劑購自廈門市鱟試劑實驗廠有限公司；流式細胞抗體購自美國Biolegend公司；EGM-2培養基及核電轉試劑購自德國Lonza公司。

1.2 外周血hEPCs的分離培養和鑒定

取健康志愿者外周血50 ml，經密度差異離心分離外周血單個核細胞，種植于預先包被人纖連蛋白的10 cm大皿中，給予EGM2培養基培養，培養21 d后可見hEPCs呈鵝軟石樣增殖，分別通過FITC標記荊豆凝集素Ⅰ(FITC-UEA-Ⅰ)和Dil標記的乙?；兔芏戎鞍譊il-ac-LDL以及流式細胞鑒定其純度。

1.3 晚期糖基化終產物制備

取人血清白蛋白，將其按照1 mg/ml濃度與葡萄糖溶液混勻后共置于37℃細胞孵箱中，按照文獻報告共孵育60 d，孵育結束后通過過夜透析方法去除葡萄糖，并經超濾濃縮分裝于-80℃冰箱備用。

1.4 干預分組

分為對照組、AGEs干預組(200 μg/ml)、TXL干預組(250、500、750 μg/ml，溶于DMSO中，并經鱟實驗內毒素檢測陰性)、TXL預先干預30 min后再給予AGEs刺激組、RAGE過表達+TXL+AGEs干預組以及MAPK信號通路激動劑(預先激動30 min)+TXL+AGEs干預組。

1.5 hEPCs過表達RAGE

使用Accutase酶(美國ebioscience公司)消化貼壁細胞，將其與攜帶GFP熒光標記的過表達RAGE受體的質粒以及配套核電轉試劑混勻，按照儀器使用說明經Nucleofector核電轉儀(德國amaxa公司)轉染，轉染3 d后經流式細胞儀鑒定轉染效率，同時蛋白電泳分析RAGE過表達水平。

1.6 hEPCs的體外內皮分化評估

使用Accutase酶消化收集貼壁細胞，種植于預先準備好的matrigel膠(美國BD公司)并給予不同干預，置于37℃度細胞孵箱中培養，培養2 h后倒置顯微鏡下觀察并拍照，使用Image J軟件分析體外管型形成水平，從而反映hEPCs體外內皮化程度。此外，干預結束后使用trizol抽取細胞mRNA，采用Taqman探針法經熒光定量PCR分析細胞表達vWF水平，每組實驗重復4次。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 hEPCs鑒定

體外培養21 d后的hEPCs鏡下呈鵝軟石樣排布，經Accutase酶消化后能夠穩定傳代，同時FITC-UEA-1和Dil-acLDL雙染色陽性，流式細胞分析證實細胞高表達CD34、CD73、CD105、CD146，但KDR、CD14、CD45和HLA-DR陰性，提示成功獲得人外周血來源EPCs可用于后續實驗。

2.2 TXL促進hEPCs體外內皮分化

給予不同濃度的TXL干預hEPCs，發現TXL可顯著提高hEPCs內皮分化程度，表現為體外管型形成能力增強，同時vWF表達水平顯著升高(圖1A-C)，以500 μg/ml作用最為顯著，進一步提高濃度并不能增強其促內皮分化的作用(P<0.05)，故此后續實驗使用該濃度作為TXL的干預劑量。

圖1 TXL對hEPCs體外內皮分化的影響注：與對照組比較：*P<0.05；與250μg/ml TXL干預組比較：?P<0.05

2.3 TXL通過RAGE-MAPK信號通路介導拮抗AGEs介導的hEPCs內皮分化異常

200 μg/ml的AGEs可顯著抑制hEPCs的體外內皮分化，該病理作用可被預先TXL干預30 min所部分阻斷之前的研究表明，RAGE-MAPK信號通路的激動參與了AGEs的病理作用，因此通過預先過表達RAGE或給予MAPK信號通路激動劑(ERK激動劑叔丁基氫醌或p38 MAPK激動劑U-46619)處理hEPCs，觀察上述信號通路對于TXL保護作用的影響發現，預先激動上述信號通路明顯減弱TXL的保護作用(圖2)，提示TXL是通過下調RAGE-MAPK信號通路進而拮抗AGEs誘導hEPCs內皮分化異常。

圖2 TXL經RAGE-MAPK信號通路拮抗AGEs誘導hEPCs體外內皮分化異常注：與對照組比較：*P<0.05；與200μg/ml AGEs干預組比較：?P<0.05；與500 μg/ml TXL+200 μg/ml AGEs干預組比較：&P<0.05

3 討論

通心絡作為一種可顯著抑制動脈粥樣硬化斑塊進展的復方中藥，已在臨床廣泛應用。通心絡由人參、水蛭、土鱉蟲、全蝎、蜈蚣、蟬蛻、降香、冰片等藥物組成，具有益氣活血、通絡止痛的功效?，F代藥理研究表明，人參具有抗氧化和改善血管內皮功能作用，水蛭具有抗凝和降血脂作用，全蝎、蜈蚣、蟬蛻則具有改善血管內皮功能、解除血管痙攣的作用。大量研究證實，通心絡可通過多種途徑延緩動脈粥樣硬化斑塊進展，其中包括促進泡沫細胞膽固醇逆轉運、加快損傷內皮修復和抑制氧化應激反應等[5～7]。我們前期的研究證實，通心絡可顯著提高體外內皮祖細胞的增殖、遷移和分泌功能，其作用呈劑量依賴性[8]。同時臨床研究也發現，通心絡可提高冠心病患者外周血內皮祖細胞含量[9]。除上述功能外，內皮分化是內皮祖細胞介導內源性血管損傷后修復的重要機制之一，因此本研究著重評估通心絡對于內皮祖細胞的體外內皮分化作用及其機制。

糖尿病作為冠心病的等危癥，中醫學將其稱為“消渴癥”，主要癥狀是口渴、多飲、多食、多尿等，其發病率呈逐年升高趨勢。尤以我國發病人群為重，呈現發病年齡提早和臨床控制率差等諸多問題，其血管病變較單純冠心病患者更為彌散且穩定性差等臨床特點，是現階段嚴重危害人民群眾身心健康的重大社會問題。糖尿病導致血管損傷的致病因素除外血糖，晚期糖基化終產物也是不可忽視的病因，特別是隨著檢測技術的不斷進步，大量研究證實，AGEs的病理作用較高血糖持續時間更長，可從多種機制引發細胞和組織功能異常。我們的前期研究證實，AGEs可導致內皮祖細胞凋亡、增殖降低，該病理作用主要是通過異常激活RAGE-MAPK信號通路實現的[10]，TXL可部分拮抗AGEs的病理作用[11]。

本研究證實，TXL自身既可顯著提高內皮祖細胞的體外內皮分化，同時還可通過下調RAGE-MAPK信號通路對抗AGEs誘導的內皮分化異常，這可能是TXL發揮抗糖尿病血管動脈粥樣硬化的新機制之一?，F今冠心病的治療策略已有單純溶栓和藥物干擾全面進入支架時代，而在支架時代如何降低支架內血栓形成成為當務之急，由此人們開發了藥物涂層支架，但隨之而來又出現了支架內內皮延遲愈合等問題?；趦绕ぷ婕毎稍隗w動員并在損傷血管局部分化的生物學特性，內皮祖細胞捕獲支架在臨床應用中取得較好的療效[12～14]，但該支架存在費用較高等問題。由本研究的結果是否可以猜測TXL可加速裸金屬支架或者藥物涂層支架內皮覆蓋，從而從根本上降低支架內管腔丟失，這方面仍需進一步的臨床深入研究。

[1] Castejon R, Jimenez-Ortiz C, Valero-Gonzalez S,et al． Decreased circulating endothelial progenitor cells as an early risk factor of subclinical atherosclerosis in systemic lupus erythematosus[J]. Rheumatology，2014， 53:631-638.

[2] Ruan C, Shen Y, Chen R, et al. Endothelial progenitor cells and atherosclerosis[J]. Frontiers in Bioscience，2013， 18:1194-1201.

[3] Ho HH, Chow WH, Ko LY, et al. Successful use of endothelial progenitor cell capture stent for treatment of left main coronary artery disease before non-cardiac surgery for abdominal aortic aneurysm[J]. International Journal of Cardiology，2010， 143:e27-29.

[4] Zhang L, Xu Q． Stem/Progenitor cells in vascular regeneration[J]. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology，2014， 34:1114-1119.

[5] Chen ZQ, Hong L, Wang H．Effect of tongxinluo capsule on platelet activities and vascular endothelial functions as well as prognosis in patients with acute coronary syndrome undergoing percutaneous coronary intervention[J]．Chinese journal of integrated traditional and Western medicine，2011， 31:487-491.

[6] Guan QG, Zeng DY, Sun XZ．Inhibitory effect and acting mechanism of Tongxinluo on IL-1beta-mediated coronary intimal hyperplasia and 5-hydroxytryptamine-induced coronary vasospasm in small swine[J]. Chinese journal of integrated traditional and Western medicine，2008， 28:627-631.

[7] 梁小衛, 孫承波, 王華, 等． 通心絡體外促進人外周血內皮祖細胞的增殖[J]. 第二軍醫大學學報，2007， 6:598-601.

[8] 苗旺, 劉恒方, 楊期東, 等． 通心絡對頸動脈粥樣硬化斑塊患者內皮祖細胞增殖能力的影響[J]. 中國實用神經疾病雜志，2010， 15:44-45.

[9] Sun C, Liang C, Ren Y, Zhen Y, et al. Advanced glycation end products depress function of endothelial progenitor cells via p38 and ERK 1/2 mitogen-activated protein kinase pathways[J]. Basic research in cardiology,2009, 104:42-49.

[10] 孫承波, 梁春, 吳宗貴, 等. 通心絡對晚期糖基化終產物誘導的內皮祖細胞存活的影響及其機制[J]. 上海醫學，2008， 10:711-714.

[11] Tan A, Farhatnia Y, Goh D, et al. Surface modification of a polyhedral oligomeric silsesquioxane poly(carbonate-urea) urethane (POSS-PCU) nanocomposite polymer as a stent coating for enhanced capture of endothelial progenitor cells[J]. Biointerphases,2013, 8:22.

[12] Yu Z, Zhu H, Lu S, et al. Accelerated endothelialization with a polymer-free sirolimus-eluting antibody-coated stent. Journal of materials science[J]. Materials in medicine,2013, 24:2601-2609.

[13] Haude M, Lee SW, Worthley SG, et al. The REMEDEE trial: a randomized comparison of a combination sirolimus-eluting endothelial progenitor cell capture stent with a paclitaxel-eluting stent. JACC[J]. Cardiovascular interventions,2013, 6:334-343.

[14] Scacciatella P, D’Amico M, Pennone M, et al. Effects of EPC capture stent and CD34+ mobilization in acute myocardial infarction[J]. Minerva cardioangiologica,2013, 61:211-219.